牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我國重要的經(jīng)濟海水養(yǎng)殖魚類之一,其肉質(zhì)鮮美,蛋白質(zhì)含量高,具有較高的營養(yǎng)價值,此外,牙鲆的生長速率具有明顯的性別差異,單性養(yǎng)殖可以有效地提高經(jīng)濟效益。精巢發(fā)育是行有性生殖動物繁殖的基礎,而精子發(fā)生則是精巢正常發(fā)育的關鍵。精子發(fā)生主要指二倍體精原細胞通過減數(shù)分裂等一系列復雜的生化反應,進而產(chǎn)生成熟的單倍體精子的過程。盡管我們對精子發(fā)生的理解有了長足的進步,相關基因和化學物質(zhì)的研究也不斷被發(fā)現(xiàn)和鑒定,但目前,關于牙鲆性腺發(fā)育和精子發(fā)生的研究多集中于性激素和性別分化相關基因的表達分析方面。此外,性腺發(fā)育和精子發(fā)生相關基因的研究又多集中于這些編碼基因的表達規(guī)律和功能分析,對其轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控研究鮮有報道,而該領域正是目前遺傳學研究的熱點。本實驗室前期通過高通量測序等技術建立了牙鲆精巢和卵巢miRNA文庫,并篩選出一批在雌雄性腺中差異表達的miRNA,其中,miR-202-5p是性腺中豐富表達,且雌雄表達差異顯著的一個miRNA。在此基礎上,本研究采用熒光定量PCR和原位雜交技術構建miR-202-5p在牙鲆不同組織和性腺發(fā)育過程中的表達譜。結... 

【文章來源】：上海海洋大學上海市

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
    1 牙鲆簡介
    2 牙鲆性腺及性腺相關基因研究
    3 MicroRNA簡介
        3.1 MicroRNA的合成機制和特征
        3.2 MicroRNA的作用機制
        3.3 MicroRNA的表達檢測方法
    4 MicroRNA在水產(chǎn)動物精巢中的作用及研究進展
    5 MiR-202-5p在精巢中的研究進展
    6 本研究的目的與意義
第一章 MiR-202-5p在牙鲆性腺中的表達分析
    1 實驗材料
        1.1 實驗魚
        1.2 試劑
        1.3 溶液配制
    2 實驗方法
        2.1 總RNA提取
        2.2 熒光定量PCR分析miR-202-5p的組織表達
            2.2.1 引物設計
            2.2.2 牙鲆各組織及不同時期性腺組織cDNA合成
            2.2.3 實時熒光定量PCR
        2.3 原位雜交技術分析miR-202-5p在牙鲆性腺中的定位表達
            2.3.1 石蠟切片
            2.3.2 H.E.染色
            2.3.3 PCR擴增vasa非編碼區(qū)
            2.3.4 PCR產(chǎn)物膠回收
            2.3.5 TA克隆
            2.3.6 轉(zhuǎn)化反應
            2.3.7 藍白斑篩選和測序
            2.3.8 質(zhì)粒提取
            2.3.9 體外合成RNA探針
            2.3.10 MiR-202-5p反義探針
            2.3.11 化學原位雜交
            2.3.12 熒光原位雜交
    3 實驗結果
        3.1 總RNA提取
        3.2 MiR-202-5p在牙鲆各組織和不同發(fā)育時期性腺中的定量表達
        3.3 MiR-202-5p在牙鲆精巢、卵巢中的定位表達
    4 討論
第二章 視黃酸與miR-202-5p作用關系研究
    1 實驗材料與試劑
        1.1 實驗試劑
        1.2 實驗試劑
    2 實驗方法
        2.1 視黃酸溶液配制
        2.2 視黃酸活體注射
        2.3 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
        2.4 引物設計
        2.5 熒光定量PCR
    3 實驗結果
        3.1 視黃酸與miR-202-5p的作用關系
        3.2 視黃酸與精巢發(fā)育精子發(fā)生相關基因的作用關系
    4 討論
第三章 雙熒光素酶報告載體的構建及miRNA靶基因鑒定
    1 實驗材料
    2 實驗方法
        2.1 MiR-202-5p靶基因預測
        2.2 Ccnd1和cbx2 3'UTR引物設計
        2.3 構建重組質(zhì)粒
            2.3.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
            2.3.2 Ccnd1和cbx2 3'UTR區(qū)克隆
            2.3.3 轉(zhuǎn)化子菌液質(zhì)粒小提
            2.3.4 雙酶切質(zhì)粒
            2.3.5 連接和轉(zhuǎn)化
        2.4 靶位點驗證
            2.4.1 細胞轉(zhuǎn)染
            2.4.2 熒光活性檢測及數(shù)據(jù)分析
    3 結果
        3.1 靶基因的預測及載體構建
        3.2 靶基因驗證
    4 討論
第四章 在精巢和原代生殖細胞水平miR-202-5p對 ccnd1和cbx2 表達的影響
    1 實驗材料與試劑
        1.1 實驗材料
        1.2 實驗試劑
    2 實驗方法
        2.1 牙鲆精巢組織體外培養(yǎng)
        2.2 牙鲆原代生殖細胞培養(yǎng)及純化
        2.3 MiR-202-5p mimics和 antagomir轉(zhuǎn)染
            2.3.1 MiR-202-5p mimics和 antagomir轉(zhuǎn)染精巢組織
            2.3.2 MiR-202-5p mimics和 antagomir轉(zhuǎn)染原代生殖細胞
        2.4 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
        2.5 熒光定量PCR
    3 結果
        3.1 原代生殖細胞純化
        3.2 轉(zhuǎn)染mimics和 antagomir的精巢組織中miR-202-5p的表達
        3.3 轉(zhuǎn)染mimics和 antagomir的精巢組織中cbx2和ccnd1 的表達
        3.4 轉(zhuǎn)染mimics和 antagomir的原代生殖細胞中miR-202-5p的表達
        3.5 轉(zhuǎn)染mimics和 antagomir的原代生殖細胞中cbx2和ccnd1 的表達
    4 討論
小結
參考文獻
發(fā)表論文
致謝



本文編號：3065001