發(fā)布時間：2020-11-12 17:03

　　 弧菌Ⅲ型系統(tǒng)效應(yīng)蛋白對宿主細(xì)胞具有致病功能,研究效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)功能對研究其致病機(jī)理和制作疫苗有重要意義。根據(jù)Gen Bank上面溶藻弧菌的基因序列,設(shè)計hop Pma J、va1686和type3hy322 3對效應(yīng)蛋白基因的引物,PCR擴(kuò)增獲得三個基因的全長片段。結(jié)果顯示:hop Pma J全長345bp,共編碼114個氨基酸殘基,生物信息學(xué)分析表明其不存在信號肽,有蛋白激酶磷酸化等位點(diǎn),三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型為同源二聚體�？寺『蜏y序分析了va1686和type3hy322基因,va1686全長為1164bp,為溶藻弧菌效應(yīng)蛋白中的膜通透蛋白基因;type3hy322全長為969bp,為溶藻弧菌效應(yīng)蛋白中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。在大腸桿菌表達(dá)type3hy322和va1686,得到Type3hy322和Va1686蛋白。通過對溶藻弧菌HY9901 hop Pma J基因的PCR擴(kuò)增、融合,酶切、連接、轉(zhuǎn)化、菌株接合、同源重組和缺失株篩選,成功能構(gòu)建缺失株Δhop Pma J,并對Δhop Pma J的生物學(xué)表型特征進(jìn)行了研究,確定突變株具有遺傳穩(wěn)定性。野生株V.alginolyticus HY9901和Δhop Pma J比較,兩者生長速率一致,Hop Pma J生物被膜形成能力,胞外蛋白酶活性沒有顯著變化,Δhop Pma J泳動能力顯著減低。Δhop Pma J對斑馬魚的其半致死量LD50為1.2×108cfu/m L,比野生株下降約有兩個數(shù)量級。對Δhop Pma J在魚體中的生物安全性及其免疫保護(hù)性進(jìn)行了研究。用106cfu/m L浸泡組30min,28d后,用野生株進(jìn)行攻毒,免疫保護(hù)率為35%,與對照組相比沒有顯著差異(R≥0.5,p≥0.05)。以105cfu/m LΔhop Pma J注射免疫斑馬魚,28d后,用108 cfu/m L野生株攻毒,免疫保護(hù)率為75%,與對照組相比差異顯著(R≤0.5,p≤0.05)。提示Hop Pma J減毒后,對宿主的免疫性有良好啟動和促進(jìn)作用。
【學(xué)位單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S941.4
【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 溶藻弧菌及其疾病
    1.2 溶藻弧菌致病因子
    1.3 Ⅲ型分泌系統(tǒng)
    1.4 弧菌的效應(yīng)蛋白功能
    1.5 疫苗
    1.6 本研究的目的意義和技術(shù)路線
2 溶藻弧菌HY9901 hop Pma J基因的克隆及其生物信息學(xué)
    2.1 實驗材料
        2.1.1 本實驗所采用質(zhì)粒和菌株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 生物信息學(xué)軟件
    2.2 實驗方法
        2.2.1 溶藻弧菌HY9901 hop Pma J、va1686和type3hy322基因的克隆
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 hop Pma J基因的全長克隆
        2.3.2 溶藻弧菌HY9901 hop Pma J基因的序列
        2.3.3 溶藻弧菌HY9901效應(yīng)蛋白Hop Pma J的理化性質(zhì)
        2.3.4 同源性及進(jìn)化分析
        2.3.5 功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測
        2.3.6 溶藻弧菌基因va1686和type3hy322的克隆
        2.3.7 type3hy322和va1686測序結(jié)果和生物信息學(xué)分析
    2.4 討論
3 V.alginolyticus T3SS效應(yīng)蛋白的原核表達(dá)
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.3 大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)條件的優(yōu)化
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 type3hy322和va1686基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建
        3.2.2 type3hy322和va1686蛋白表達(dá)和誘導(dǎo)
        3.2.3 重組表達(dá)載體表達(dá)條件優(yōu)化
    3.3 討論
4 溶藻弧菌HY9901hop Pma J基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)表型
    4.1 實驗方法
        4.1.1 PCR擴(kuò)增hop Pma J的基因上游序列和下游序列
        4.1.2 hop Pma J缺失片段的融合
        4.1.3 自殺載體構(gòu)建
        4.1.4 連接和轉(zhuǎn)化
        4.1.5 突變株構(gòu)建
        4.1.6 第二次同源重組和缺失株篩選
        4.1.7 驗證
        4.1.8 突變株HY9901 Hop Pma J的遺傳穩(wěn)定性檢測
        4.1.9 HY9901 Hop Pma J的生長速率比較
        4.1.10 Δhop Pma J胞外蛋白酶活性檢測
        4.1.11 Δhop Pma J細(xì)菌泳動實驗
        4.1.12 HY9901 Hop Pma J生物被膜形成能力檢測
50)檢測'>        4.1.13 Δhop Pma J半數(shù)致死率(LD₅₀)檢測
        4.1.14 統(tǒng)計學(xué)處理
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 hop Pma J基因的克隆
        4.2.2 缺失株的構(gòu)建
        4.2.3 缺失株的生物學(xué)表型特征
    4.3 討論
5 突變株作為疫苗在魚體中的存活能力檢測及其免疫保護(hù)效果
    5.1 實驗材料與方法
        5.1.1 實驗材料
        5.1.2 Δhop Pma J在魚體中的存活能力
        5.1.3 菌液制備和接種
        5.1.4 免疫保護(hù)率的測定
        5.1.5 統(tǒng)計學(xué)處理
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 △hop Pma J在魚體中的存活能力檢測
        5.2.2 免疫保護(hù)性
    5.3 討論
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號：2881001