根據(jù)《新獸藥研制管理辦法》及中獸藥、天然藥物分類及注冊資料要求中第三類藥物的研制規(guī)定,本研究采用超微粉碎技術(shù)將復(fù)方中草藥HD-1原料制為粉劑。通過對HD-1粉劑開展原料定性鑒別、制劑工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其對盾纖毛蟲(蟹棲異阿腦蟲Mesanophrys carcini)的抑制效果分析、大菱鲆血清相關(guān)免疫酶的影響、組織病理研究、靶動物的安全性試驗,為HD-1粉劑申報新漁藥奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.HD-1君藥的定性鑒別及制作工藝以現(xiàn)行2015年版《中國獸藥典》及《中藥材顯微鑒別彩色圖譜》為標(biāo)準(zhǔn),對HD-1中的君藥—青蒿、檳榔、川楝子進行性狀鑒別及顯微鑒別。結(jié)果表明:青蒿表面黃綠色或棕黃色,直徑2~7mm,葉暗綠色,具有特異氣香,味微苦;顯微鑒別特征為木薄壁細胞呈淡綠色,類正方形,葉色素塊細胞呈棕黃色,類長方形,大小不一,表皮細胞呈不規(guī)則形狀。檳榔扁圓形,直徑20~30mm,表面淡紅棕色,質(zhì)堅硬,氣微,味澀;顯微鑒別特征為外胚乳與內(nèi)胚乳形成大理石樣花紋,內(nèi)胚乳細胞為白色,多角形。川楝子類球形,表面金黃色至棕黃色,直徑17~30mm,外果皮為革質(zhì),果肉呈淡黃色,果核卵圓形,質(zhì)堅硬,氣特異,味酸、苦;顯微鑒別特征為果皮石細胞呈不規(guī)則的長多角形,種皮細胞呈橙黃色,近方形,種皮色素層細胞腔內(nèi)充滿紅棕色物。采用超微粉碎技術(shù)對三個批次的HD-1原料粉碎效果研究表明:HD-1原料經(jīng)過200目的超微粉碎后產(chǎn)品收率較高,三個批次的產(chǎn)品收率為98.2%、98.0%、97.6%;外觀為粉末狀,黃褐色或青褐色,氣味清香,味甘苦、微澀,平均水分含量為2.44%、2.58%、2.00%,均符合《中國獸藥典》規(guī)定。顯微鑒別結(jié)果顯示,超微粉碎后藥材的細胞破壁率高,粉碎粒度均勻。2.HD-1產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究參考《中國獸藥典》對上述三個批次原料制作的HD-1產(chǎn)品進行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。結(jié)果顯示:三批次原料制作的HD-1均為粉末狀、灰黃色,氣味清香,味甘苦;水分含量分別為2.48%、2.55%、2.12%,均未超過規(guī)定的5%;粒度百分比分別為99.54%、98.23%、98.37%,藥物粉碎均勻,大于規(guī)定的95%;產(chǎn)品的溶解度較好,有部分沉淀產(chǎn)生;產(chǎn)品休止角分別為26.6°、29.2°、28.4°,與普通粉的休止角相比顯著減小;平均裝量差異分別為0.70%、0.68%、0.67%,均未超過規(guī)定的±5%;細菌含量和酵母菌含量分別≤10~3CFU/g、≤10~2CFU/g,均達到微生物限度檢查的標(biāo)準(zhǔn),霉菌較少,大腸埃希菌未檢出;薄層色譜法檢查中,三批樣品色譜斑點清晰,重現(xiàn)性好,陰性對照無干擾。各項指標(biāo)檢查結(jié)果均符合藥典中規(guī)定。3.HD-1對大菱鲆盾纖毛蟲病的治療藥效研究利用復(fù)方中草藥HD-1拌餌投喂的方法對大菱鲆盾纖毛蟲病進行治療效果研究,拌餌劑量分別為0(對照)、10g/kg、15g/kg、20g/kg,治療時間為35d。結(jié)果表明:(1)不同組別0(對照)、10g/kg、15g/kg、20g/kg的累計死亡率分別為46.47%、45.29%、38.12%和25.41%,說明復(fù)方中草藥HD-1能夠降低患盾纖毛蟲病大菱鲆的死亡率,其中20g/kg組累計死亡率顯著低于其他各組。(2)復(fù)方中草藥HD-1對病灶處蟲體的抑制效果分析,第35d時,對照組和10g/kg組蟲體活力強,內(nèi)質(zhì)清晰可見;15g/kg組蟲體活力變?nèi)?開始萎縮,呈球形,內(nèi)儲顆粒聚集;20g/kg組蟲體變小,內(nèi)質(zhì)透明,核著色消失,兩端組織松弛,呈開放狀。(3)拌餌投喂復(fù)方中草藥HD-1后大菱鲆血清免疫指標(biāo)結(jié)果表明,治療期間血清中的超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)活性、免疫球蛋白M(IgM)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、血清補體C3/C4、過氧化氫酶(CAT)、一氧化氮合酶(NOS)出現(xiàn)升高的趨勢,分別在21d或28d時達到最高值后趨于穩(wěn)定,15g/kg和20g/kg組顯著高于10g/kg組。綜上說明20g/kg拌餌治療劑量對大菱鲆盾纖毛蟲病治療效果較好。4.HD-1對大菱鲆盾纖毛蟲病的病理研究對比分析治療過程中對照組和20g/kg劑量組大菱鲆鰓、皮下肌肉、腦等病灶處組織病理和超微病理,結(jié)果可顯示:第0~14d時20g/kg組與對照組的每個病灶處的病理相似,有大量蟲體寄生在組織中;21d時20g/kg組病灶處的組織開始逐漸開始恢復(fù),肌束溶解情況減輕,腦實質(zhì)損傷程度降低,鰓小片、肝臟、腎臟等組織結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù),組織中的蟲體數(shù)量降低,開始萎縮;28d時各組織基本恢復(fù)正常,肌纖維束和心肌纖維排列較整齊,鰓絲和鰓小片排列整齊,小腦顆粒層細胞形態(tài)清晰,肝細胞結(jié)構(gòu)趨于正常,腸道內(nèi)環(huán)肌結(jié)構(gòu)完整,脾臟紅髓和白髓界限清晰,炎癥消失,腎小球、腎小管等排列整齊,質(zhì)地較均勻,組織中有少量蟲體,蟲體萎縮成球形,內(nèi)儲顆粒聚集。35d時各組織恢復(fù)正常,組織中偶見蟲體,蟲體內(nèi)質(zhì)逐漸透明,核著色消失。通過跟蹤20g/kg組到45d時,各組織器官與健康大菱鲆組織相同。5.HD-1對大菱鲆的安全性評價為了評價復(fù)方中草藥HD-1臨床用藥的安全性,本文對靶動物大菱鲆拌餌投喂推薦治療劑量的0倍、1倍(20g/kg)、3倍(60g/kg)、5倍(100g/kg)、10倍(200g/kg)的HD-1,通過大菱鲆的成活率、生長性能、臟器系數(shù)、組織學(xué)等指標(biāo)評價其臨床應(yīng)用的安全性。結(jié)果表明:各組大菱鲆健康、活力強,成活率均為100%;投喂劑量為1倍組的增重率顯著高于對照組,3倍組增重率與對照組差異不顯著,高于5倍時增重率顯著低于對照組;臟器系數(shù)和組織學(xué)觀察,各組別與對照組差異不顯著。因此,以推薦治療劑量10倍拌餌給藥對靶動物大菱鲆是安全的,且1倍劑量組對大菱鲆的生長具有促進作用。
【學(xué)位單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S943
【部分圖文】：

圖 2-1 三種藥材外觀性狀圖Fig.2-1 The appearance charts of three medicinal materials.注：A、B、C 三種藥材原圖均引用自中國植物圖像庫; A1、B1、C1 分別為檳榔藥材、川楝子藥材、青蒿藥材。Note: The original drawings of three medicinal materials A, B and C are cited from the Chinese Plant Image Library. A1, B1 C1 are Areca catechu、MeLia toosendan and Artemisia annua medicinal materials.表 2-1 三批藥材性狀鑒別結(jié)果Table 2-2 The identification results of three batch medicinal materials藥材 形狀 顏色 直徑/mm 質(zhì)地 氣 味檳榔 1 扁球狀 淡黃棕色 22～29 堅硬 微香 微苦檳榔 2 扁球狀 淡紅棕色 20～28 堅硬 微香 澀、微苦檳榔 3 扁球狀 淡黃棕色 25～30 堅硬 微香 微苦川楝子 1 橢圓狀 棕色 20～30 硬 香 酸、微苦川楝子 2 橢圓狀 土黃色 18～27 硬 香 酸、微苦川楝子 3 橢圓狀 黃棕色 17～30 硬 香 酸、微苦

.3.2 顯微鑒定結(jié)果嚴(yán)格根據(jù)《中國獸藥典》及《中藥材顯微鑒別彩色圖譜》中規(guī)定，對青蒿、檳榔、川子三種藥材分別進行顯微鑒定。結(jié)果如下：3.2.1 青蒿顯微鑒定結(jié)果青蒿粉末特征：呈綠褐色或黃綠色。顯微鏡下主要觀察青蒿莖部、髓部及葉子的細胞構(gòu)，對其進行初步的鑒定。可見莖表皮細胞呈網(wǎng)狀，髓部細胞為白色，呈類方形或類多形，葉表皮細胞呈黃綠色。所鑒定結(jié)果與文獻中描述的相同[85]，如圖 2-2 所示：

圖 2-3 川楝子顯微鏡鑒別圖Fig.2-3 The powder micrograph of MeLia toosendanA：橫切面 transection section；B：縱切面 longitudinal section；C：果皮石細胞 pericarp stone cells；D：種皮表皮胞 epidermal cells of testa；E：種皮含晶細胞 testa cells containing crystal；F：種皮色素層 pigment layer of testa2.3.2.3 檳榔顯微鑒定結(jié)果檳榔粉末特征：呈黃棕色或紅棕色。顯微鏡下可見檳榔的外胚乳較狹窄，插入內(nèi)胚中，形成錯入組織，似大理石樣花紋；內(nèi)胚乳細胞為白色，多角形，紋孔大，含有油滴糊粉粒。如圖 2-4 所示：
【參考文獻】

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本文編號：2876726