進(jìn)入21世紀(jì),刺參養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展。池塘養(yǎng)殖模式是在山東、遼寧、河北和福建等地區(qū)是刺參的主要模式,由于池塘養(yǎng)殖過(guò)程中刺參放養(yǎng)密度大、養(yǎng)殖工藝落后、池塘清淤周期長(zhǎng)等問(wèn)題,導(dǎo)致池塘中的生態(tài)環(huán)境失衡,疾病頻發(fā),而使用益生菌,則可以避免上述問(wèn)題。本文開(kāi)展了刺參養(yǎng)殖系統(tǒng)中拮抗病原菌的本土益生菌篩選、生理特性及抑菌蛋白的分離純化等分析,分析了益生菌的最佳使用濃度及其對(duì)刺參非特異性免疫酶活力和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,最后探索分析了益生菌的添加對(duì)池塘水質(zhì)和菌群結(jié)構(gòu)的影響,并對(duì)所篩選的菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序研究,以期為益生菌的正確使用提供理論依據(jù)。1、一株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)的分離及其生理特性研究2014年5月,從東營(yíng)的刺參(Apostichopus japonicus)養(yǎng)殖池塘環(huán)境中對(duì)水樣和底泥樣品進(jìn)行了益生菌的篩選,共獲得了66株可培養(yǎng)細(xì)菌。以刺參“腐皮綜合征”主要致病菌為指示菌進(jìn)行拮抗作用實(shí)驗(yàn),使用選擇培養(yǎng)基對(duì)菌株的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力進(jìn)行測(cè)定,篩選獲得一株潛在益生菌株DY-6,并進(jìn)行了生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA序列分析、菌株生長(zhǎng)特性及其對(duì)刺參的安全性研究。結(jié)果表明:DY-6對(duì)其指示菌假交替單胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)、燦爛弧菌(Vibrio splendidus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)均有良好的抑制作用,抑菌圈分別達(dá)到24 mm、22 mm、27 mm和37 mm,對(duì)淀粉和蛋白培養(yǎng)基的水解直徑分別為28 mm和20 mm。利用該菌對(duì)刺參進(jìn)行高濃度脅迫實(shí)驗(yàn)測(cè)試其安全性,實(shí)驗(yàn)期間浸浴組和投喂組的刺參狀態(tài)良好,沒(méi)有發(fā)病和死亡現(xiàn)象。利用細(xì)菌生理生化和16S rDNA序列分析表明,DY-6與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis CP015911)的相似性為99%。因此,初步鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)。同時(shí),將該菌株與商品化微生態(tài)制劑產(chǎn)品中分離的4株益生菌進(jìn)行了比較,DY-6在溫度20~35℃、鹽度0~35范圍內(nèi)其生長(zhǎng)較快,優(yōu)于上述4株菌,4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,10 h達(dá)到生長(zhǎng)高峰。篩選的貝萊斯芽孢桿菌DY-6(Bacillus velezensis DY-6)具有良好抑菌能力,生長(zhǎng)速度快,并且具有廣溫廣鹽的優(yōu)點(diǎn),不僅能夠降低疾病發(fā)生率,還可更好地適應(yīng)黃河口地區(qū)夏季水溫偏高、鹽度波動(dòng)大的特點(diǎn),由此具有良好的益生菌商業(yè)化開(kāi)發(fā)潛力。2、貝萊斯芽孢桿菌DY-6對(duì)刺參生長(zhǎng)、酶活、菌群結(jié)構(gòu)的影響及其相關(guān)性分析實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度貝萊斯芽孢桿菌DY-6添加對(duì)刺參增重率、體腔液非特異性免疫酶活力的影響,確定了最佳使用濃度,并利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了該濃度下貝萊斯芽孢桿菌DY-6對(duì)刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,實(shí)驗(yàn)周期為49 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:添加貝萊斯芽孢桿菌DY-6的各實(shí)驗(yàn)組,刺參的增重率均高于對(duì)照組,其中1×10~3 CFU/mL組增重率最高;各實(shí)驗(yàn)組的刺參體腔液非特異性免疫酶活力均呈現(xiàn)出不同程度的提高,當(dāng)添加量為1×10~3 CFU/mL或1×10~4 CFU/mL時(shí)刺參的非特異性免疫酶活力提高較大,并在21 d或28 d時(shí)達(dá)到高峰期。綜上,貝萊斯芽孢桿菌DY-6的最佳使用濃度為1×10~3 CFU/mL。利用細(xì)菌16S rDNA測(cè)序分析方法研究了1×10~3 CFU/mL的添加量對(duì)刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌DY-6的介入使刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)處于動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程,并以28 d為分界,將前后時(shí)間點(diǎn)的刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著分為兩類,并在14 d時(shí)菌群結(jié)構(gòu)的豐富度最高,21 d時(shí)多樣性最高。研究還發(fā)現(xiàn):貝萊斯芽孢桿菌DY-6添加后刺參的非特異性免疫酶活力與腸道中的部分細(xì)菌存在顯著相關(guān)性,顯著相關(guān)的細(xì)菌主要集中在Firmicutes,Proteobacteria,Bacteroidetes三個(gè)門。3、貝萊斯芽孢桿菌DY-6對(duì)刺參養(yǎng)殖池塘水質(zhì)及水體菌群結(jié)構(gòu)的影響研究了貝萊斯芽孢桿菌DY-6對(duì)刺參的生長(zhǎng)及養(yǎng)殖池塘水質(zhì)因子的影響,并采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化,實(shí)驗(yàn)周期為55 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與對(duì)照池塘相比,添加貝萊斯芽孢桿菌DY-6的實(shí)驗(yàn)池塘刺參的增重率和特定增長(zhǎng)率均高于對(duì)照池塘,分別達(dá)到112%,1.36%/d;貝萊斯芽孢桿菌DY-6的使用,能夠減低池塘中NO_2-N、COD和NH_3-N的含量,實(shí)驗(yàn)后期雖然實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì),但仍低于對(duì)照池塘�；诟咄繙y(cè)序技術(shù)分析養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)表明:投放貝萊斯芽孢桿菌DY-6之前水體樣品的細(xì)菌物種聚為一類,而投放貝萊斯芽孢桿菌DY-6之后的樣品聚為一類,對(duì)樣品的PCoA主坐標(biāo)分析可知,未添加貝萊斯芽孢桿菌DY-6之前的W0為一組,添加貝萊斯芽孢桿菌DY-6之后的W1、W2、W3、W4為一組,說(shuō)明貝萊斯芽孢桿菌使用后水體菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化;Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)呈升高趨勢(shì),說(shuō)明實(shí)驗(yàn)池塘內(nèi)的水體細(xì)菌的豐富度和多樣性呈上升的趨勢(shì),并在實(shí)驗(yàn)最后期的W4組最高;而對(duì)各采樣時(shí)間點(diǎn)水樣進(jìn)行組間的unifrac距離箱線圖分析,5次樣品中的優(yōu)勢(shì)菌均存在顯著的差異(P0.05)。4、貝萊斯芽孢桿菌DY-6(Bacillus velezensis DY-6)胞外抑菌蛋白特性分析及細(xì)菌全基因組測(cè)序采用平板玻璃紙覆蓋法,制備貝萊斯芽孢桿菌DY-6的胞外產(chǎn)物和胞內(nèi)產(chǎn)物,以溶藻弧菌為指示菌,分別檢測(cè)胞外產(chǎn)物和胞內(nèi)產(chǎn)物的抑菌活性。結(jié)果表明,貝萊斯芽孢桿菌DY-6的胞外產(chǎn)物和胞內(nèi)產(chǎn)物均能抑制指示菌的生長(zhǎng),且胞外產(chǎn)物的抑菌活性好于胞內(nèi)產(chǎn)物。同樣研究了不同培養(yǎng)時(shí)間胞外產(chǎn)物的抑菌活性,結(jié)果表明,培養(yǎng)24~72 h后的胞外產(chǎn)物抑菌活性最好;不同濃度的飽和硫酸銨沉淀后的胞外產(chǎn)物的抑菌活性略有不同,當(dāng)飽和硫酸銨的濃度為60~80%、80%時(shí)的抑菌效果優(yōu)于其他濃度。對(duì)貝萊斯芽孢桿菌DY-6進(jìn)行De Novo全基因組測(cè)序,結(jié)果表明,菌株DY-6的大小為3.79 M,共預(yù)測(cè)到3858個(gè)ORF,占總基因組長(zhǎng)的89.1%。在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比,有2487個(gè)基因可以找到分類信息,其中2232個(gè)可以查找到明確的蛋白功能分類,255個(gè)為未知功能蛋白;在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),其基因和基因產(chǎn)物屬性主要集中在細(xì)胞組成,酶催化及代謝等過(guò)程。CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果表明DY-6的酶相關(guān)基因主要為糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶等6類,經(jīng)過(guò)試驗(yàn)及分析表明,具有較大的發(fā)展研究潛力。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S947.9;S917.4
【部分圖文】：

圖 2-1 候選菌株 DY-6 的革蘭氏染色 圖 2-2 候選菌株 DY-6 的透射電鏡Fig.2-1 The Gram's staining of candidate Fig.2-2 The TEM photograph of candidatstrain DY-6 strain DY-6表 2-1 菌株 DY-6 對(duì)病原菌的抑制作用Tab.2-1 The antagonistic activities of candidate strain DY-6菌株名稱Strain Name抑菌圈直徑Diameter of inhibition zone(mm)假交替單胞菌P. nigrifaciens燦爛弧菌V. splendidus副溶血弧菌V.parahaemolyticus溶藻弧菌V.alginolyticusDY-6 24 22 27 37

圖 2-1 候選菌株 DY-6 的革蘭氏染色 圖 2-2 候選菌株 DY-6 的透射電鏡Fig.2-1 The Gram's staining of candidate Fig.2-2 The TEM photograph of candidatstrain DY-6 strain DY-6表 2-1 菌株 DY-6 對(duì)病原菌的抑制作用Tab.2-1 The antagonistic activities of candidate strain DY-6菌株名稱Strain Name抑菌圈直徑Diameter of inhibition zone(mm)假交替單胞菌P. nigrifaciens燦爛弧菌V. splendidus副溶血弧菌V.parahaemolyticus溶藻弧菌V.alginolyticusDY-6 24 22 27 37

圖 2-1 候選菌株 DY-6 的革蘭氏染色 圖 2-2 候選菌株 DY-6 的透射電鏡Fig.2-1 The Gram's staining of candidate Fig.2-2 The TEM photograph of candidatestrain DY-6 strain DY-6表 2-1 菌株 DY-6 對(duì)病原菌的抑制作用Tab.2-1 The antagonistic activities of candidate strain DY-6菌株名稱Strain Name抑菌圈直徑Diameter of inhibition zone(mm)假交替單胞菌P. nigrifaciens燦爛弧菌V. splendidus副溶血弧菌V.parahaemolyticus溶藻弧菌V.alginolyticusDY-6 24 22 27 37

【參考文獻(xiàn)】

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