【摘要】：羅非魚((Oreochromis)原產(chǎn)于熱帶、亞熱帶,是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)重點(diǎn)推廣養(yǎng)殖的國(guó)際性魚類,是當(dāng)前最重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。但羅非魚性成熟早、繁殖周期短,且具有筑巢、口孵和護(hù)幼的繁殖習(xí)性,雌雄混養(yǎng)會(huì)因繁殖行為消耗大量能量,而影響生長(zhǎng),特別是雌魚在性成熟后生長(zhǎng)極其緩慢,過度繁殖導(dǎo)致池塘種群密度過高,出池規(guī)格相差懸殊,商品率低,飼料系數(shù)高,大幅降低了羅非魚產(chǎn)品質(zhì)量與養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。目前,常用單雄性養(yǎng)殖的羅非魚性成熟早及性成熟后的筑巢和守巢的繁殖習(xí)性依然存在,對(duì)羅非魚商品魚質(zhì)量和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益有一定的影響。為了消除性成熟所帶來的不利影響,生產(chǎn)由不育個(gè)體所組成的群體是理想的選擇。利用促性腺激素釋放激素(GnRH)主動(dòng)免疫可以抑制動(dòng)物生殖器官發(fā)育,促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、改善肉質(zhì)、提高生產(chǎn)性能,已在哺乳動(dòng)物中取得了良好的效果。我們?cè)诹_非魚養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)一定比例的不育魚,其具有生長(zhǎng)速度快、肥滿度高、性腺(卵巢)嚴(yán)重退化等特點(diǎn),本研究擬采用GnRH-A抗原主動(dòng)免疫全雌吉富羅非魚,研究GnRH-A抗原對(duì)羅非魚生殖功能的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)理,探索激素免疫制備不育羅非魚技術(shù)的可行性。本文開展了不育羅非魚和普通羅非魚(雌性、雄性)生長(zhǎng)性狀、性腺發(fā)育和激素水平差異研究,選育了全雌吉富羅非魚家系作為實(shí)驗(yàn)材料,合成并制備了 GnRH-A抗原,利用不同劑量抗原免疫全雌吉富羅非魚,研究羅非魚生長(zhǎng)、性別比例、GnRH抗體水平、血清激素含量(GnRH、FSH、LH、E2、T)、免疫組化指標(biāo)變化規(guī)律,篩選最佳處理劑量進(jìn)行主動(dòng)免疫,開展GnRH-A免疫羅非魚的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1.研究發(fā)現(xiàn)不育羅非魚的體重、體長(zhǎng)均顯著大于雌性羅非魚,也高于雄性羅非魚,但差異性不顯著,三者肥滿度的排序?yàn)椴挥_非魚雄性羅非魚雌性羅非魚,但差異不顯著。不育羅非魚的血清GH和T含量最高,血清E2含量顯著低于雌雄羅非魚,垂體GnRH和血清FSH、LH水平均處于雌雄羅非魚之間。2.采用激素誘導(dǎo)控制羅非魚性別的方法,進(jìn)行了偽雄與全雌吉富羅非魚家系3個(gè)世代的選育,家系選育F3代自然培育羅非魚的雌性率為99.9%,獲得全雌家系6個(gè),甲基睪丸酮誘導(dǎo)全雌家系可獲得理論全偽雄羅非魚家系,F3代羅非魚選育家系的平均體重提高了 22.97%,最優(yōu)秀家系(F3-13)的平均體重比對(duì)照組提高了 34.32%。偽雄和全雌羅非魚是育種和實(shí)驗(yàn)研究良好的材料。3.根據(jù)羅非魚GnRH的氨基酸序列,設(shè)計(jì)了用于制備抗原的GnRH-A氨基酸序列(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-{D-Ala}-Leu-Arg-Pro-NHEt),進(jìn)行人工合成與純化,獲得了目的GnRH-A(純度:98.38%)。采用碳二亞胺法偶聯(lián)法、PBS透析法,偶聯(lián)純化獲得BSA-GnRH-A溶液(濃度:4.7165 mg/mL),UV、SDS-PAGE驗(yàn)證了 GnRH-A多肽與BSA成功偶聯(lián)。將BSA-GnRH-A復(fù)合物與弗氏佐劑(包括弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑)按照1:1混合,經(jīng)充分乳化,制成具有性狀穩(wěn)定、無菌、對(duì)羅非魚無害等特征的CFU-BSA-GnRH-A和IFU-BSA-GnRH-A抗原乳劑。4.以200、100、50、25μg/尾4個(gè)不同劑量CFU-BSA-GnRH-A免疫全雌吉富羅非魚,14天后以相同劑量IFU-BSA-GnRH-A加強(qiáng)免疫一次,測(cè)定羅非魚性別比例、生長(zhǎng)性狀和臟器指數(shù)。結(jié)果顯示:GnRH-A免疫對(duì)羅非魚生殖系統(tǒng)具有長(zhǎng)期持續(xù)的影響,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,各處理組雌性率持續(xù)下降的趨勢(shì)未見減緩,以100 μg/尾劑量處理組性轉(zhuǎn)變效果最佳;在實(shí)驗(yàn)前期處理組羅非魚生長(zhǎng)速度受到抑制,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)基本上恢復(fù)到對(duì)照組水平;實(shí)驗(yàn)70天200μg/尾處理組羅非魚的肥滿度極顯著高于對(duì)照組,100 Μg/尾處理組羅非魚肥滿度也較高,但與對(duì)照組無顯著性差異;200 μg/尾處理組性腺成熟系數(shù)和脾臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組,其他處理組性腺成熟系數(shù)低于對(duì)照組,但僅有50μg/尾處理組達(dá)到了顯著水平,50μg/尾處理組羅非魚的肝臟指數(shù)顯著低于對(duì)照組。5.GnRH-A抗原首免后羅非魚體內(nèi)快速產(chǎn)生GnRH抗體,加強(qiáng)免疫導(dǎo)致抗體含量繼續(xù)升高,并維持顯著高于對(duì)照組的水平。各處理組血清GnRH含量均在首免后下降再持穩(wěn),200、100和50 μg/尾處理組GnRH含量一直極顯著低于對(duì)照組,25 μg/尾處理組在28天開始低于對(duì)照組。各處理組血清FSH和LH含量總體表現(xiàn)為先上升后下降(或持穩(wěn))的趨勢(shì),實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)200、100 mg/尾處理組的FSH、LH含量均與對(duì)照組無顯著性差異,但低劑量組均極顯著高于對(duì)照組。處理組和對(duì)照組血清E2含量表現(xiàn)為升高趨勢(shì),除28、42天,200 μg/尾處理組外,不同時(shí)間各處理組的E2水平均顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)過程中各處理組T含量未見明顯的變化規(guī)律性,大部分與對(duì)照組無顯著性差異。6.以4個(gè)不同劑量GnRH-A抗原免疫70天后,取羅非魚垂體和性腺,采用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定垂體基因表達(dá),用免疫組織化學(xué)法對(duì)性腺GnRH進(jìn)行定位與分析。結(jié)果顯示:各處理組垂體GnRHR mRNA表達(dá)量均與對(duì)照組無顯著性差異;100μg/尾處理組羅非魚垂體LH-β mRNA表達(dá)量(2-ΔΔCT值:1.46±0.20)顯著低于對(duì)照組(P0.05);50和25μg/尾處理組羅非魚垂體LH-β mRNA表達(dá)極顯著高于對(duì)照組(P0.01),高劑量處理組與對(duì)照組無顯著性差異。結(jié)合血清對(duì)應(yīng)激素含量分析相關(guān)性發(fā)現(xiàn):垂體GnRHR與LH-β基因表達(dá)呈顯著高度正相關(guān)(0.899*),垂體FSH-β基因表達(dá)與血清FSH含量呈極顯著高度正相關(guān)(0.972**),血清中GnRH含量與其他指標(biāo)相關(guān)性均極低,且無顯著性相關(guān)。羅非魚性腺中GnRH免疫反應(yīng)物呈黃色或棕黃色,對(duì)照組GnRH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少,著色淺,各處理組中不育魚的性腺中GnRH著色較深,陽(yáng)性細(xì)胞多于處理組及對(duì)照組的雌性羅非魚;100、50μg處理組組織化學(xué)評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P0.05),其他組與對(duì)照組無顯著性差異。7.以100μg/尾GnRH-A抗原劑量主動(dòng)免疫羅非魚,首免70天后采集性腺,采用RNA-seq和DIA技術(shù)開展GnRH-A免疫羅非魚的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究。結(jié)果顯示GnRH-A免疫后,羅非魚性腺轉(zhuǎn)錄組分析獲得差異表達(dá)基因644個(gè),其中上調(diào)基因80個(gè),下調(diào)基因564個(gè);蛋白質(zhì)組分析獲得差異表達(dá)蛋白1150個(gè),其中上調(diào)表達(dá)351個(gè),下調(diào)表達(dá)799個(gè);轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組差異表達(dá)模式一致的基因共209個(gè),其中9個(gè)表達(dá)上調(diào),200個(gè)表達(dá)下調(diào),表明GnRH免疫羅非魚后,抑制了性腺基因的表達(dá),下調(diào)基因功能主要集中于single-organism process、binding、cellular process、metabolic process和catalytic activity,涉及的通路主要包括ECM-receptor interaction、Focal adhesion、Cardiac muscle contraction、Oxidative phosphorylation。涉及GnRH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的6個(gè)差異表達(dá)基因均為表達(dá)下調(diào)。此外,還篩選獲得多個(gè)GnRH-A免疫羅非魚后與性腺發(fā)育相關(guān)的重要功能基因。本研究從分子水平證明了 GnRH-A主動(dòng)免疫抑制羅非魚性腺發(fā)育的有效性,為闡明GnRH-A抗原免疫的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S965.125
【圖文】：

灥逡逑一．邋ｉ逡逑圖１－２羅非魚的性腺（左邊為不育羅非魚，右邊為雌性羅非魚）逡逑Ｆｉｇ．邋１邋－２邋Ｔｈｅ邋ｇｏｎａｄｓ邋ｏｆ邋ｔｉｌａｐｉａ邋（邋Ｓｔｅｒｉｌｅ邋ｔｉｌａｐｉａ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ，邋ｆｅｍａｌｅ邋ｔｉｌａｐｉａ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｒｉｇｈｔ）逡逑２０逡逑

注：同列標(biāo)注標(biāo)不同字母表示組間差異顯著（Ｐ＜0．0５），相同字母表示組間差異不顯著（Ｐ＞０．０５），下同。逡逑３．２羅非魚生殖器官觀察逡逑圖１－１羅非魚外生殖器（從左到右分別是雄性、雌性和不育羅非魚）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｅｘｔｅｒｎａｌ邋ｇｅｎｉｔａｌｉａ邋ｏｆ邋ｔｉｌａｐｉａ邋（Ｆｒｏｍ邋ｌｅｆｔ邋ａｒｅ邋ｍａｌｅ，邋ｆｅｍａｌｅ邋ａｎｄ邋ｓｔｅｒｉｌｅ邋ｔｉｌａｐｉａ）逡逑灥逡逑一．邋ｉ逡逑圖１－２羅非魚的性腺（左邊為不育羅非魚，右邊為雌性羅非魚）逡逑Ｆｉｇ．邋１邋－２邋Ｔｈｅ邋ｇｏｎａｄｓ邋ｏｆ邋ｔｉｌａｐｉａ邋（邋Ｓｔｅｒｉｌｅ邋ｔｉｌａｐｉａ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ，邋ｆｅｍａｌｅ邋ｔｉｌａｐｉａ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｒｉｇｈｔ）逡逑２０逡逑

ＨＰＬＣ色譜圖上，基線穩(wěn)定呈一條水平直線，提示設(shè)備運(yùn)行正常，主峰峰形良好，逡逑峰形瘦，柱效高，滯留時(shí)間穩(wěn)定，為１２．６１ｍｉｎ，峰面積與進(jìn)樣量呈明顯的線型關(guān)系，逡逑ＧｎＲＨ－Ａ多肽主峰純度為９８．３８％邋（圖２－２），表明合成的ＧｎＲＨ－Ａ純度較高。圖中出現(xiàn)逡逑了一個(gè)負(fù)峰可能是由后期流動(dòng)相吸收本底過高或有空氣進(jìn)入引起。逡逑１邐Ｉ逡逑１邋二逡逑１５Ｃ逡逑�。牛义希隋义希椋哄义希哼姡捱姡椋剩椋者婂义希佩澹殄澹哼姡冲澹殄澹渝�？邐７邋ｆｔ邋９邐？邋Ｍ邋１２邐１３邋ｉ？邋？邐？邋Ｔ７邋ｔ＊邋？邐３５邐ｉ邋Ｏ邋ｉｔ逡逑圖２－２純化的ＧｎＲＨ－Ａ色譜圖逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋Ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＧｎＲＨ－Ａ邋ｂｙ邋ＨＰＬＣ逡逑（注：洗脫梯度為２２％￣４７％乙腈，３０ｍｉｎ：流速：ｌｍＬ／ｍｉｎ：邋ＵＶ檢測(cè)波長(zhǎng)為２８０ｎｍ。）逡逑３．２抗原偶聯(lián)結(jié)果逡逑以合成純化的ＧｎＲＨ－Ａ為標(biāo)準(zhǔn)品，采用紫外分光光度法測(cè)定ＢＳＡ－ＧｎＲＨ－Ａ濃度，逡逑建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖２－３，邋ＧｎＲＨ－Ａ濃度與２２０ｎｍ處對(duì)應(yīng)吸光度的線性回歸方程為：逡逑ｙ＝４．２１３ｘ＋０．００２４邋（Ｒ２＝０．９９８）。２２０ｎｍ邋下邋ＢＳＡ－ＧｎＲＨ－Ａ邋樣品的三次測(cè)量值分別為邋０．２２３、逡逑０．２２４和０．２２３

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本文編號(hào)：2806046