【摘要】：大彈涂魚為廣溫廣鹽性魚類,生活環(huán)境充斥著各種各樣的病原菌,其中鰻弧菌是一種能夠引起水產(chǎn)養(yǎng)殖嚴(yán)重?fù)p失的一種致病菌,并且大彈涂魚生活的兩棲環(huán)境的鹽度變化較為劇烈。先天免疫是抵抗病原體入侵和感染的第一傳感器和屏障,Toll樣受體是一種重要的先天免疫成員。本文采用生物信息學(xué)分析了大彈涂魚5個(gè)TLR基因序列;并且通過(guò)鰻弧菌刺激在不同鹽度中生活的大彈涂魚,探究其在不同鹽度下受到細(xì)菌刺激后的5種TLR基因的表達(dá)模式;另外利用所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分子進(jìn)化分析,探究5種TLR基因的分子進(jìn)化情況。主要結(jié)果如下:(1)大彈涂魚TLR3基因在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性;TLR3基因在大彈涂魚9個(gè)健康組織中(腸、鰓、眼、腎、肝臟、腦、肌肉、脾臟和皮膚)均有表達(dá),但是在肝臟、脾臟和皮膚中具有較高的表達(dá)水平;TLR3基因在不同鹽度下應(yīng)對(duì)鰻弧菌入侵時(shí)都有不同程度的反應(yīng),另外,在正常鹽度下,在應(yīng)對(duì)病原體入侵時(shí),脾臟反應(yīng)較快,在高鹽度下剛好相反;TLR3基因的位點(diǎn)模型和進(jìn)化枝-位點(diǎn)模型都沒(méi)有檢測(cè)到進(jìn)化位點(diǎn)。(2)大彈涂魚TLR5基因在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性;TLR5基因在大彈涂魚9個(gè)健康組織中均有表達(dá),在肝臟和脾臟中的表達(dá)水平較高;在不同鹽度下,TLR5基因在應(yīng)對(duì)鰻弧菌入侵時(shí)都有不同程度的反應(yīng),在正常鹽度下,在病原體入侵時(shí),脾臟反應(yīng)較快,在高鹽度下剛好相反;在正常鹽度下,肝臟和脾臟中TLR5的反應(yīng)速度要快于高鹽情況下的反應(yīng)速度,并且脾臟的反應(yīng)激烈程度要高于肝臟,而高鹽組恰好相反;TLR5的位點(diǎn)模型結(jié)果顯示有兩個(gè)進(jìn)化位點(diǎn)(101H,453N),但是在進(jìn)化枝-位點(diǎn)模型中未檢測(cè)到進(jìn)化位點(diǎn)。(3)大彈涂魚TLR7、TLR8和TLR9基因在結(jié)構(gòu)上都是保守的;在大彈涂魚9個(gè)健康組織中,TLR7、TLR8和TLR9基因在肝臟和脾臟中的表達(dá)水平都相對(duì)較高;TLR7、TLR8和TLR9基因在不同鹽度下應(yīng)對(duì)鰻弧菌入侵時(shí)都有不同程度的反應(yīng),在正常鹽度下,肝臟和脾臟中TLR7的反應(yīng)速度都要快于高鹽情況下的反應(yīng)速度,脾臟TLR7的反應(yīng)激烈程度要高于肝臟,而高鹽組恰好相反;與TLR7相反,高鹽度脅迫致使TLR8的反應(yīng)程度比正常組激烈;TLR9在應(yīng)對(duì)鰻弧菌入侵時(shí),肝臟的反應(yīng)速度要快于脾臟;另外,鹽度脅迫致使TLR9在面對(duì)鰻弧菌入侵時(shí)的反應(yīng)變得遲緩;利用所構(gòu)建的TLR7、TLR8和TLR9基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分子進(jìn)化分析,位點(diǎn)模型顯示在TLR7和TLR9中分別檢測(cè)到了兩個(gè)(649Q,674E)和一個(gè)進(jìn)化位點(diǎn)(410S),TLR8未檢測(cè)到進(jìn)化位點(diǎn);進(jìn)化枝-位點(diǎn)模型結(jié)果顯示在TLR7(485S)和TLR9(373R)的大彈涂魚祖先枝各檢測(cè)到了一個(gè)進(jìn)化位點(diǎn)。綜上所述,大彈涂魚的5個(gè)TLR基因在結(jié)構(gòu)上是保守的,在大彈涂魚9個(gè)健康組織中,5個(gè)TLR基因均有表達(dá),其中肝和脾中5個(gè)TLR基因的表達(dá)水平相對(duì)較高。此外,在鰻弧菌感染不同鹽度環(huán)境中的大彈涂魚后,肝臟和脾臟中5個(gè)TLR基因的表達(dá)趨勢(shì)表明TLR基因在應(yīng)對(duì)外部病原體入侵時(shí)起到了重要作用,并且鹽度脅迫在一定程度上影響了5個(gè)TLR基因的反應(yīng)。根據(jù)位點(diǎn)模型結(jié)果可知5個(gè)TLR基因的進(jìn)化分析結(jié)果表明TLR3和TLR8是高度保守的,而TLR5、TLR7和TLR9在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了適應(yīng)性進(jìn)化。最后,進(jìn)化枝-位點(diǎn)模型結(jié)果表明,大彈涂魚的TLR7和TLR9從水生環(huán)境向兩棲環(huán)境的轉(zhuǎn)變的過(guò)程中產(chǎn)生了適應(yīng)性進(jìn)化。
【圖文】：

13圖 2-1 TLR3 核苷酸和氨基酸序列Fig 2.1 Nucleotide and amino acid sequences of TLR3矩形陰影部分表示起始密碼子(ATG)，平行四邊形陰影部分表示終止密碼子(TAA)，梯形陰影部表示 mRNA 不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)域(ATTTA)，下劃線部分表示 LRR 結(jié)構(gòu)域，雙實(shí)線部分表示 LRR_TY結(jié)構(gòu)域，實(shí)線框部分表示 LRR_CT 結(jié)構(gòu)域，虛線部分表示 TIR 結(jié)構(gòu)域，虛線框部分表示跨膜結(jié)域。2.2.2 健康組織中 TLR3 基因的表達(dá)量取健康大彈涂魚的腸、鰓、眼、腎、肝臟、腦、肌肉、脾臟和皮膚進(jìn)行定量檢測(cè)如圖 2-2 所示，TLR3 基因在所有檢測(cè)的健康組織中均有表達(dá)。此外，TLR3 基因在臟、脾臟和皮膚中具有較高的表達(dá)水平，在腎臟、腦和肌肉中的表達(dá)量相對(duì)較低。

涂魚的 9 個(gè)組織(腸，鰓，眼，腎，肝，腦，肌肉，脾和皮膚)中 TLR3 基因相的相對(duì)表達(dá)水平The relative expression levels of TLR3 gene for β-actin in the 9 tissues (IntestinalKidney, Liver, Brain, Muscle, Spleen and Skin) of B. pectinirostris注：1.腸道；2.鰓；3.眼；4.腎臟；5.肝臟；6.腦；7.肌肉；8.脾臟；9.皮R3 基因的免疫應(yīng)答模式 2-3 可知，，在肝臟中，TLR3 基因在對(duì)照組和高鹽對(duì)照組中均無(wú)顯菌感染后，鰻弧菌組中 TLR3 表達(dá)量在 36 h 顯著增加并達(dá)到最高峰表達(dá)量大約為 2.5，一直到 72 h 都顯著高于對(duì)照組；高鹽對(duì)照組在 12 h 顯著高于高鹽對(duì)照組，達(dá)到最高峰時(shí)的相對(duì)表達(dá)量只有 1.都處于正常水平。在脾臟中，TLR3 基因在對(duì)照組和高鹽對(duì)照組中異；但是當(dāng)鰻弧菌感染后，鰻弧菌組中 TLR3 在 6 h 和 12 h 迅速上平，然后在 24 h 后降低，在 36 h 后再次增加并維持在較高水平；3 表達(dá)量只有在 12 h 顯著高于高鹽對(duì)照組，其他時(shí)間點(diǎn)都處于正常
【學(xué)位授予單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2683985