發(fā)布時間：2020-05-27 18:53

【摘要】：大彈涂魚為廣溫廣鹽性魚類,生活環(huán)境充斥著各種各樣的病原菌,其中鰻弧菌是一種能夠引起水產(chǎn)養(yǎng)殖嚴重損失的一種致病菌,并且大彈涂魚生活的兩棲環(huán)境的鹽度變化較為劇烈。先天免疫是抵抗病原體入侵和感染的第一傳感器和屏障,Toll樣受體是一種重要的先天免疫成員。本文采用生物信息學(xué)分析了大彈涂魚5個TLR基因序列;并且通過鰻弧菌刺激在不同鹽度中生活的大彈涂魚,探究其在不同鹽度下受到細菌刺激后的5種TLR基因的表達模式;另外利用所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進行分子進化分析,探究5種TLR基因的分子進化情況。主要結(jié)果如下:(1)大彈涂魚TLR3基因在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性;TLR3基因在大彈涂魚9個健康組織中(腸、鰓、眼、腎、肝臟、腦、肌肉、脾臟和皮膚)均有表達,但是在肝臟、脾臟和皮膚中具有較高的表達水平;TLR3基因在不同鹽度下應(yīng)對鰻弧菌入侵時都有不同程度的反應(yīng),另外,在正常鹽度下,在應(yīng)對病原體入侵時,脾臟反應(yīng)較快,在高鹽度下剛好相反;TLR3基因的位點模型和進化枝-位點模型都沒有檢測到進化位點。(2)大彈涂魚TLR5基因在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性;TLR5基因在大彈涂魚9個健康組織中均有表達,在肝臟和脾臟中的表達水平較高;在不同鹽度下,TLR5基因在應(yīng)對鰻弧菌入侵時都有不同程度的反應(yīng),在正常鹽度下,在病原體入侵時,脾臟反應(yīng)較快,在高鹽度下剛好相反;在正常鹽度下,肝臟和脾臟中TLR5的反應(yīng)速度要快于高鹽情況下的反應(yīng)速度,并且脾臟的反應(yīng)激烈程度要高于肝臟,而高鹽組恰好相反;TLR5的位點模型結(jié)果顯示有兩個進化位點(101H,453N),但是在進化枝-位點模型中未檢測到進化位點。(3)大彈涂魚TLR7、TLR8和TLR9基因在結(jié)構(gòu)上都是保守的;在大彈涂魚9個健康組織中,TLR7、TLR8和TLR9基因在肝臟和脾臟中的表達水平都相對較高;TLR7、TLR8和TLR9基因在不同鹽度下應(yīng)對鰻弧菌入侵時都有不同程度的反應(yīng),在正常鹽度下,肝臟和脾臟中TLR7的反應(yīng)速度都要快于高鹽情況下的反應(yīng)速度,脾臟TLR7的反應(yīng)激烈程度要高于肝臟,而高鹽組恰好相反;與TLR7相反,高鹽度脅迫致使TLR8的反應(yīng)程度比正常組激烈;TLR9在應(yīng)對鰻弧菌入侵時,肝臟的反應(yīng)速度要快于脾臟;另外,鹽度脅迫致使TLR9在面對鰻弧菌入侵時的反應(yīng)變得遲緩;利用所構(gòu)建的TLR7、TLR8和TLR9基因系統(tǒng)發(fā)育樹進行分子進化分析,位點模型顯示在TLR7和TLR9中分別檢測到了兩個(649Q,674E)和一個進化位點(410S),TLR8未檢測到進化位點;進化枝-位點模型結(jié)果顯示在TLR7(485S)和TLR9(373R)的大彈涂魚祖先枝各檢測到了一個進化位點。綜上所述,大彈涂魚的5個TLR基因在結(jié)構(gòu)上是保守的,在大彈涂魚9個健康組織中,5個TLR基因均有表達,其中肝和脾中5個TLR基因的表達水平相對較高。此外,在鰻弧菌感染不同鹽度環(huán)境中的大彈涂魚后,肝臟和脾臟中5個TLR基因的表達趨勢表明TLR基因在應(yīng)對外部病原體入侵時起到了重要作用,并且鹽度脅迫在一定程度上影響了5個TLR基因的反應(yīng)。根據(jù)位點模型結(jié)果可知5個TLR基因的進化分析結(jié)果表明TLR3和TLR8是高度保守的,而TLR5、TLR7和TLR9在長期進化過程中產(chǎn)生了適應(yīng)性進化。最后,進化枝-位點模型結(jié)果表明,大彈涂魚的TLR7和TLR9從水生環(huán)境向兩棲環(huán)境的轉(zhuǎn)變的過程中產(chǎn)生了適應(yīng)性進化。
【圖文】：

13圖 2-1 TLR3 核苷酸和氨基酸序列Fig 2.1 Nucleotide and amino acid sequences of TLR3矩形陰影部分表示起始密碼子(ATG)，平行四邊形陰影部分表示終止密碼子(TAA)，梯形陰影部表示 mRNA 不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)域(ATTTA)，下劃線部分表示 LRR 結(jié)構(gòu)域，雙實線部分表示 LRR_TY結(jié)構(gòu)域，實線框部分表示 LRR_CT 結(jié)構(gòu)域，虛線部分表示 TIR 結(jié)構(gòu)域，虛線框部分表示跨膜結(jié)域。2.2.2 健康組織中 TLR3 基因的表達量取健康大彈涂魚的腸、鰓、眼、腎、肝臟、腦、肌肉、脾臟和皮膚進行定量檢測如圖 2-2 所示，TLR3 基因在所有檢測的健康組織中均有表達。此外，TLR3 基因在臟、脾臟和皮膚中具有較高的表達水平，在腎臟、腦和肌肉中的表達量相對較低。

涂魚的 9 個組織(腸，鰓，眼，腎，肝，腦，肌肉，脾和皮膚)中 TLR3 基因相的相對表達水平The relative expression levels of TLR3 gene for β-actin in the 9 tissues (IntestinalKidney, Liver, Brain, Muscle, Spleen and Skin) of B. pectinirostris注：1.腸道；2.鰓；3.眼；4.腎臟；5.肝臟；6.腦；7.肌肉；8.脾臟；9.皮R3 基因的免疫應(yīng)答模式 2-3 可知，，在肝臟中，TLR3 基因在對照組和高鹽對照組中均無顯菌感染后，鰻弧菌組中 TLR3 表達量在 36 h 顯著增加并達到最高峰表達量大約為 2.5，一直到 72 h 都顯著高于對照組；高鹽對照組在 12 h 顯著高于高鹽對照組，達到最高峰時的相對表達量只有 1.都處于正常水平。在脾臟中，TLR3 基因在對照組和高鹽對照組中異；但是當鰻弧菌感染后，鰻弧菌組中 TLR3 在 6 h 和 12 h 迅速上平，然后在 24 h 后降低，在 36 h 后再次增加并維持在較高水平；3 表達量只有在 12 h 顯著高于高鹽對照組，其他時間點都處于正常
【學(xué)位授予單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4

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本文編號：2683985