【摘要】：草魚呼腸孤病毒(Grass Crap Reovirus,GCRV)是水生呼腸孤病毒屬中毒力最強(qiáng)、我國淡水魚養(yǎng)殖業(yè)危害最大的一種病毒,該病毒能引起草魚發(fā)生出血病導(dǎo)致大量死亡而給我國的草魚養(yǎng)殖業(yè)造成非常大的經(jīng)濟(jì)損失。病原學(xué)復(fù)雜、毒株變異大、缺少針對(duì)性防控措施是導(dǎo)致該疫病持續(xù)流行的主要原因。至今,已報(bào)道的分離株有30多株,各分離株在細(xì)胞培養(yǎng)特性、毒力、基因組帶型、基因序列等各方面均存在較大的不同。2012年8月,廣州白云區(qū)某草魚養(yǎng)殖場(chǎng)疑似發(fā)生出草魚出血病疫情,患病草魚主要臨床癥狀為腸道出血嚴(yán)重,腸炎癥狀明顯,鰓充血呈紅色,其它部位癥狀不明顯。采集病魚的腸道、肝臟、脾臟和腎臟組織,剪碎研磨制備組織勻漿液接種草魚吻端成纖維細(xì)胞(Proboscis Snout into Fibers,PSF)細(xì)胞進(jìn)行病毒分離,盲傳至第二代開始出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)。用感染病毒的PSF細(xì)胞制備電鏡負(fù)染切片,電鏡下觀察到呈六邊形,無囊膜,大小約70nm呈晶格狀排列的病毒粒子。同時(shí)通過采用三重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)采集的組織和接毒后的PSF細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行病毒檢測(cè),在腸、肝、脾、腎臟及細(xì)胞培養(yǎng)液中均擴(kuò)增出約500bp左右的單一條帶,組織中以腸道的條帶最明顯。對(duì)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果顯示,與GCRV 873株和GSRV的核苷酸序列相似性分別為93%和92%。將PSF細(xì)胞增殖后的病毒液超速離心進(jìn)行濃縮,提取濃縮后的GCRV基因組,進(jìn)行SDS-PAGE電泳帶型分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),新分離毒株11個(gè)條帶,和I型的873毒株的帶型比較接近,只是3個(gè)大片段存在差異。結(jié)合臨床癥狀、細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)、電鏡觀察、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果、基因序列同源性、全基因組SDS-PAGE電泳帶型,初步鑒定分離到的毒株為一株新的草魚呼腸孤病毒,暫時(shí)把它命名為GCRV GZ1208。將Z1208種毒接種PSF細(xì)胞,采用TCID50測(cè)定方法來測(cè)定該分離株接種PSF細(xì)胞后的病毒滴度,結(jié)果為10-8.5/0.1mL。用濃度為10-3.5/0.1mL TCID50的病毒液感染稀有泩?chǎng)a和一月齡草魚進(jìn)行回歸感染試驗(yàn),回歸感染2周后未死亡的魚,以不同基因型的強(qiáng)度毒株攻毒,進(jìn)行交叉免疫保護(hù)試驗(yàn)。回歸感染試驗(yàn)表明,稀有泩?chǎng)a和草魚感染GZ1208毒株后感染率均為100%,但死亡率分別為43.3%和35%;交叉免疫保護(hù)試驗(yàn)表明,GZ1208毒株對(duì)II型強(qiáng)毒株HuNan1307沒有免疫保護(hù)效果,但對(duì)I型毒株JX-01有較好的保護(hù)效果。參考GCRV其它分離株基因組序列設(shè)計(jì)引物,RT-PCR擴(kuò)增和克隆了GZ1208毒株的全部基因節(jié)段,并測(cè)定了其全全因組序列。GZ1208基因組全長為23.696Kb,S1至S11節(jié)段的大小分別為3949bp、3877bp、3702bp、2320bp、2239bp、2039bp、1414bp、1297bp、1130bp、909bp、820bp。用DNAStar、ORF Finder軟件和GenBank數(shù)據(jù)庫對(duì)測(cè)定的全基因組序列進(jìn)行基因組特征、編碼氨基酸、同源性等進(jìn)行分析,并基于各個(gè)節(jié)段編碼的多肽序列制作系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,GZ1208基因組各節(jié)段在末端均有保守序列,大部分節(jié)段的都是5’GUUAUUU…UUCAUC3’。GZ1208各節(jié)段核苷酸序列與104毒株(III型)相應(yīng)節(jié)段的相似性在32.4%至50.6%之間,與HZ08(II型)毒株的相似性為38.4%至52.8%之間,與AGCRV的相似性在52.3%至69.1%之間,與873(I型)毒株的相似性在90.7%至98.3%之間,與GSRV的相似性在91.5%至99.2%之間。基于各個(gè)節(jié)段基因編碼的多肽序列建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明,GZ1208株與873株和GSRV聚為同一支。序列同源性比較顯示,GZ1208株S5節(jié)段與873株的S5同源性較高,而與GSRV則相對(duì)較低,而在S9節(jié)段與GSRV核苷酸序列的同源性顯著高于GCRV 873,這個(gè)現(xiàn)象表明,該分離株可能是不同毒株通過重配形成的一個(gè)新分離株。綜上所述,GZ1208為一株草魚呼腸孤病毒新分離株,與873株同屬I型GCRV。其基因組帶型和基因組特征與I型的代表株GCRV 873和GSRV相似性最高,核苷酸和多肽序列相似性比較結(jié)果顯示,GZ1208一些節(jié)段與873株相似性最高,而另一些節(jié)段與GSRV的相似性最高,推斷新分離的GZ1208毒株可能是不同毒株之間通過重配形成的新毒株,該研究不但豐富了GCRV病毒庫和全基因組序列數(shù)據(jù)庫,而且也為GCRV遺傳變異規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 2-1 發(fā)病草魚Figure2-1 Onset grass carp 細(xì)胞感染病毒后的形態(tài)變化第 2 代出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），觀察病毒感染后的變化：細(xì)胞逐漸脫落，先是小范圍的脫落一些細(xì)胞，，最后是成片的脫落，，在脫落位置形成大塊的空斑， 2-2。

圖 2-1 發(fā)病草魚Figure2-1 Onset grass carp.2 6 天內(nèi) PSF 細(xì)胞感染病毒后的形態(tài)變化病毒盲傳至第 2 代出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），觀察病毒感染后的 PSF 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)變化：細(xì)胞逐漸脫落，先是小范圍的脫落一些細(xì)胞，然后是脫細(xì)胞逐漸增多，最后是成片的脫落，在脫落位置形成大塊的空斑，脫落細(xì)胞狀漂浮。如圖 2-2。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S943

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本文編號(hào)：2676084