【摘要】：目前,水產(chǎn)動物的病毒性疾病給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重影響我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。先天性免疫是魚類免疫系統(tǒng)的重要組成部分,是防御病毒入侵的第一道屏障,因而先天性免疫在水產(chǎn)動物的病毒防御中發(fā)揮著重要的作用,而至今為止并未有七鰓鰻感染病毒的報道,因此,深入研究七鰓鰻的抗病毒免疫防御機(jī)制對探索魚類病毒防治的方法具有重要的現(xiàn)實意義。此外,七鰓鰻(Lampetra japonica)是最原始的脊椎動物之一,因此研究其先天性免疫對了解免疫系統(tǒng)的起源具有十分重要的意義。在先天性免疫系統(tǒng)中視黃酸(維甲酸)誘導(dǎo)基因蛋白I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)是識別雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)病毒核酸的主要模式受體之一,近年來,研究人員已經(jīng)從多種低等脊椎動物中克隆并鑒定了RIG-I受體及相關(guān)基因,極大的推動了低等脊椎動物抗病毒免疫領(lǐng)域發(fā)展。本文對七鰓鰻的RIG-I樣受體,相關(guān)基因及其抗病毒免疫信號通路進(jìn)行了初步研究。首先,七鰓鰻不僅對dsRNA病毒模擬物poly(I:C)(polyinosinic-polycytidylic acid)刺激具有免疫應(yīng)答反應(yīng),激活RIG-I樣受體及其信號通路相關(guān)分子。通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對poly(I:C)刺激后的七鰓鰻進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),數(shù)量最多的基因集中于蛋白翻譯修飾和降解,通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集發(fā)現(xiàn)基因多集中在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、運輸和分解代謝(transport and catabolism)和免疫系統(tǒng)(immune system)的信號通路上,說明七鰓鰻對于poly(I:C)的刺激產(chǎn)生了免疫應(yīng)答;通過進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析從中篩選出poly(I:C)刺激相關(guān)信號通路的19個基因,主要覆蓋于RIG-I樣受體信號通路,其中白細(xì)胞介素8(interleutin-8,IL-8)和核因子抑制因子α(NF-kappa-B inhibitor alpha,NFKBIA)在不同組別的比較中表達(dá)量均上調(diào);綜合分析可得出,七鰓鰻不僅對dsRNA病毒刺激能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答,同時存在RIG-I樣受體及其信號通路的相關(guān)分子,為后期七鰓鰻RIG-I受體及其抗病毒信號通路的研究奠定了基礎(chǔ)。其次,七鰓鰻在受poly(I:C)和草魚呼腸弧dsRNA病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)刺激能激活RIG-I/MAVS和TLR3/TRIF,啟動核調(diào)控抗病毒免疫信號通路,從而產(chǎn)生IL-8和Mx效應(yīng)分子以抑制病毒增殖。通過GCRV感染過表達(dá)RIG-I或線粒體抗病毒信號蛋白(Mitochondrial Antiviral Signaling Protein,MAVS)的草魚卵巢細(xì)胞系(grass carp ovary cell line,CO),MTT法檢測證明七鰓鰻的RIG-I和MAVS的過表達(dá)能夠抵抗GCRV的感染;而且通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測,表明七鰓鰻的RIG-I或MAVS的過表達(dá)均能夠使HEK293細(xì)胞中NF-κB和干擾素激活反應(yīng)元件(interferon-sensitive responsive element,ISRE)表達(dá)上調(diào),從而激活干擾素(interferon,IFN)抗病毒信號通路;通過poly(I:C)體外刺激(轉(zhuǎn)染)七鰓鰻細(xì)胞和體內(nèi)GCRV腹腔注射免疫,并用QPCR方法檢測分析發(fā)現(xiàn),無論是體外刺激還是體內(nèi)刺激均激活七鰓鰻RIG-I/MAVS以及TLR3/TRIF依賴的核調(diào)控的抗病毒信號通路。同時,七鰓鰻抗病毒免疫信號通路的激活同時也能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴的細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抗病毒作用。通過在細(xì)胞中過表達(dá)七鰓鰻MAVS蛋白,激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)七鰓鰻MAVS定位于線粒體,同時高內(nèi)涵檢測發(fā)現(xiàn)伴隨活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生;同時通過QPCR檢測,與對照組相比,Bax表達(dá)量顯著升高,Bcl-2表達(dá)量顯著下降,且與免疫印跡檢測結(jié)果一致,同時還發(fā)現(xiàn)伴隨有細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)的釋放,結(jié)果表明,七鰓鰻MAVS的過表達(dá)能激活細(xì)胞內(nèi)線粒體依賴的細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到抑制病毒增殖的目的。本文研究結(jié)果初步闡明了七鰓鰻在受到體內(nèi)和體外刺激后不僅能激活RIG-I/MAVS和TLR3/TRIF啟動核調(diào)控的抗病毒免疫信號通路,抑制病毒增殖,同時還可以激活細(xì)胞內(nèi)線粒體依賴的細(xì)胞凋亡信號通路,從而發(fā)揮抗病毒作用;本研究有利于人們對脊椎動物抗病毒免疫進(jìn)化的認(rèn)識,為后期無頜類脊椎動物在該方面的研究提供了數(shù)據(jù)支持。
【圖文】：

七鰓鰻RIG-I 和MAVS 的分子特征及其在抗病毒免疫中的信號通路 RLRs 含有與哺乳動物 RLRS相似的結(jié)構(gòu)域。所有 RLRs 分旋酶結(jié)構(gòu)域(DEXDc)、螺旋酶結(jié)構(gòu)域(HELICc)、調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)、RIG-I 和 MDA5 的 N 端區(qū)域有 2 個 caspase 激活和募集omain, CARD)，但 LGP2 中沒有(圖 1)，其中 CARD 在信號轉(zhuǎn)AVS 通過 N 端 CARD 結(jié)構(gòu)域與 RIG-I 相互作用，從而傳遞。

七鰓鰻RIG-I 和MAVS 的分子特征及其在抗病毒免疫中的信號通路(β-defensin)、hepcidin、NK-lysin、piscidin 和肝表達(dá)抗菌肽-2 (liver-obial peptide-2, LEAP-2)。表 1 第二代測序技術(shù)的特點及檢測方法b. 1 Characteristics and detection methods of the second generation sequencing techno序技術(shù) 測序長度 具體步驟 特點術(shù) 300-800 個bp1、構(gòu)建測序文庫。片段兩端錨定接頭；2、乳液PCR擴(kuò)增，固定于磁珠后PCR；3、焦磷酸測序。讀長長，但是準(zhǔn)確高。技術(shù) 100~200bp1、構(gòu)建測序文庫。兩端加接頭；2、橋式擴(kuò)增，解鏈后固定于芯片進(jìn)行PCR：3、測序。性價比最高、應(yīng)用技術(shù) 幾十個bp1、文庫制備；2、乳液 PCR/磁珠富集。3、微珠沉積4、連接測序。最高的通量，測序正。
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S941.41

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本文編號：2670218