【摘要】：目前,水產(chǎn)動物的病毒性疾病給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,嚴重影響我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。先天性免疫是魚類免疫系統(tǒng)的重要組成部分,是防御病毒入侵的第一道屏障,因而先天性免疫在水產(chǎn)動物的病毒防御中發(fā)揮著重要的作用,而至今為止并未有七鰓鰻感染病毒的報道,因此,深入研究七鰓鰻的抗病毒免疫防御機制對探索魚類病毒防治的方法具有重要的現(xiàn)實意義。此外,七鰓鰻(Lampetra japonica)是最原始的脊椎動物之一,因此研究其先天性免疫對了解免疫系統(tǒng)的起源具有十分重要的意義。在先天性免疫系統(tǒng)中視黃酸(維甲酸)誘導基因蛋白I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)是識別雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)病毒核酸的主要模式受體之一,近年來,研究人員已經(jīng)從多種低等脊椎動物中克隆并鑒定了RIG-I受體及相關基因,極大的推動了低等脊椎動物抗病毒免疫領域發(fā)展。本文對七鰓鰻的RIG-I樣受體,相關基因及其抗病毒免疫信號通路進行了初步研究。首先,七鰓鰻不僅對dsRNA病毒模擬物poly(I:C)(polyinosinic-polycytidylic acid)刺激具有免疫應答反應,激活RIG-I樣受體及其信號通路相關分子。通過高通量轉錄組測序技術對poly(I:C)刺激后的七鰓鰻進行了數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),數(shù)量最多的基因集中于蛋白翻譯修飾和降解,通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集發(fā)現(xiàn)基因多集中在信號轉導(signal transduction)、運輸和分解代謝(transport and catabolism)和免疫系統(tǒng)(immune system)的信號通路上,說明七鰓鰻對于poly(I:C)的刺激產(chǎn)生了免疫應答;通過進一步數(shù)據(jù)分析從中篩選出poly(I:C)刺激相關信號通路的19個基因,主要覆蓋于RIG-I樣受體信號通路,其中白細胞介素8(interleutin-8,IL-8)和核因子抑制因子α(NF-kappa-B inhibitor alpha,NFKBIA)在不同組別的比較中表達量均上調;綜合分析可得出,七鰓鰻不僅對dsRNA病毒刺激能夠產(chǎn)生免疫應答,同時存在RIG-I樣受體及其信號通路的相關分子,為后期七鰓鰻RIG-I受體及其抗病毒信號通路的研究奠定了基礎。其次,七鰓鰻在受poly(I:C)和草魚呼腸弧dsRNA病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)刺激能激活RIG-I/MAVS和TLR3/TRIF,啟動核調控抗病毒免疫信號通路,從而產(chǎn)生IL-8和Mx效應分子以抑制病毒增殖。通過GCRV感染過表達RIG-I或線粒體抗病毒信號蛋白(Mitochondrial Antiviral Signaling Protein,MAVS)的草魚卵巢細胞系(grass carp ovary cell line,CO),MTT法檢測證明七鰓鰻的RIG-I和MAVS的過表達能夠抵抗GCRV的感染;而且通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測,表明七鰓鰻的RIG-I或MAVS的過表達均能夠使HEK293細胞中NF-κB和干擾素激活反應元件(interferon-sensitive responsive element,ISRE)表達上調,從而激活干擾素(interferon,IFN)抗病毒信號通路;通過poly(I:C)體外刺激(轉染)七鰓鰻細胞和體內GCRV腹腔注射免疫,并用QPCR方法檢測分析發(fā)現(xiàn),無論是體外刺激還是體內刺激均激活七鰓鰻RIG-I/MAVS以及TLR3/TRIF依賴的核調控的抗病毒信號通路。同時,七鰓鰻抗病毒免疫信號通路的激活同時也能誘導細胞發(fā)生線粒體依賴的細胞凋亡,從而發(fā)揮抗病毒作用。通過在細胞中過表達七鰓鰻MAVS蛋白,激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)七鰓鰻MAVS定位于線粒體,同時高內涵檢測發(fā)現(xiàn)伴隨活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生;同時通過QPCR檢測,與對照組相比,Bax表達量顯著升高,Bcl-2表達量顯著下降,且與免疫印跡檢測結果一致,同時還發(fā)現(xiàn)伴隨有細胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)的釋放,結果表明,七鰓鰻MAVS的過表達能激活細胞內線粒體依賴的細胞凋亡,從而達到抑制病毒增殖的目的。本文研究結果初步闡明了七鰓鰻在受到體內和體外刺激后不僅能激活RIG-I/MAVS和TLR3/TRIF啟動核調控的抗病毒免疫信號通路,抑制病毒增殖,同時還可以激活細胞內線粒體依賴的細胞凋亡信號通路,從而發(fā)揮抗病毒作用;本研究有利于人們對脊椎動物抗病毒免疫進化的認識,為后期無頜類脊椎動物在該方面的研究提供了數(shù)據(jù)支持。
【圖文】：

七鰓鰻RIG-I 和MAVS 的分子特征及其在抗病毒免疫中的信號通路 RLRs 含有與哺乳動物 RLRS相似的結構域。所有 RLRs 分旋酶結構域(DEXDc)、螺旋酶結構域(HELICc)、調節(jié)結構、RIG-I 和 MDA5 的 N 端區(qū)域有 2 個 caspase 激活和募集omain, CARD)，但 LGP2 中沒有(圖 1)，其中 CARD 在信號轉AVS 通過 N 端 CARD 結構域與 RIG-I 相互作用，從而傳遞。

七鰓鰻RIG-I 和MAVS 的分子特征及其在抗病毒免疫中的信號通路(β-defensin)、hepcidin、NK-lysin、piscidin 和肝表達抗菌肽-2 (liver-obial peptide-2, LEAP-2)。表 1 第二代測序技術的特點及檢測方法b. 1 Characteristics and detection methods of the second generation sequencing techno序技術 測序長度 具體步驟 特點術 300-800 個bp1、構建測序文庫。片段兩端錨定接頭；2、乳液PCR擴增，固定于磁珠后PCR；3、焦磷酸測序。讀長長，但是準確高。技術 100~200bp1、構建測序文庫。兩端加接頭；2、橋式擴增，解鏈后固定于芯片進行PCR：3、測序。性價比最高、應用技術 幾十個bp1、文庫制備；2、乳液 PCR/磁珠富集。3、微珠沉積4、連接測序。最高的通量，測序正。
【學位授予單位】：遼寧師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S941.41

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