【摘要】：目的:凝血因子是一種在機體抗凝、促凝的凝血酶級聯(lián)反應中有重要作用的生物活性蛋白,其功能主要是催化纖維蛋白原轉化為纖維蛋白和作為信號因子激發(fā)免疫系統(tǒng),研究顯示人凝血因子制劑是治療血友病A的有效藥物,鱟血淋巴制備的鱟試劑(Limulus amoebocyte lysate,LAL)對于極微量的病毒和污染物有較強敏感度,蛇凝血因子在炎癥和治療血栓病上有重要作用。河蟹(Eriocheir sinensis)為我國重要的經濟蟹類,近年來由于養(yǎng)殖規(guī)模的擴大及水質的退化,病害造成的損失越發(fā)嚴重,為應對病害除了使用抗生素等藥物外,對于河蟹自身免疫的研究也越來越受到重視。如何最大程度地激發(fā)其免疫潛能,獲得抗病力強的個體,是水產動物遺傳育種領域值得探究的主要課題。本研究通過克隆河蟹凝血因子基因cDNA序列,分析其基因結構,原核表達獲得重組蛋白并制備多克隆抗體,運用Real-time RT-PCR、Western blot技術探究凝血因子在河蟹生理及病理條件下mRNA和蛋白的表達特征,揭示該基因在河蟹血凝及免疫過程中可能發(fā)揮的作用,以期為河蟹的抗病育種提供重要的理論基礎。方法:運用RACE技術從河蟹肝臟中克隆凝血因子全長cDNA,通過pET32a(+)原核表達系統(tǒng)表達凝血因子融合蛋白,并經鎳柱純化融合蛋白。通過Real-time RT-PCR技術分別檢測:(1)健康河蟹各組織的凝血因子mRNA相對表達水平;(2)嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)感染河蟹后0 h,1.5 h,3 h,6 h,12h,24 h和48 h在心臟、肝胰臟和血淋巴中凝血因子mRNA相對表達量的變化情況;(3)河蟹螯足折斷后0.5 h,1 h,1.5 h,3 h和6 h在心臟、肝胰臟和血淋巴中凝血因子mRNA的相對表達量變化情況。并以鎳柱純化的河蟹凝血因子融合蛋白為抗原免疫家兔,制備河蟹凝血因子多克隆抗體,經瓊脂雙擴散法和間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗體效價后,用Western bolt驗證抗體的特異性,同時檢測嗜水氣單胞菌感染和斷肢后河蟹心臟、肝胰臟和血淋巴中天然凝血因子蛋白的分泌特征。結果:河蟹凝血因子cDNA全長2279bp,包含一個936bp的開放閱讀框,編碼長度為311個氨基酸的多肽,預測分子量為33.75kDa,理論等電點為9.38。同源性及系統(tǒng)進化樹分析結果顯示,河蟹凝血因子蛋白一級結構與大多數物種凝血酶原相似,并與內達華古白蟻(Zootermopsis nevadensis)凝血因子親緣關系最近。對凝血因子在河蟹不同組織中mRNA相對表達水平的研究表明,凝血因子在心臟、肝胰臟和血淋巴中較其他組織表達量較高。嗜水氣單胞菌感染后,河蟹肝胰臟和血淋巴中凝血因子mRNA相對表達量顯著上調,并在3 h時達到高峰,心臟組織則在感染后24 h時達到高峰。人為折斷河蟹螯足后,在心臟、肝胰臟和血淋巴中凝血因子mRNA相對表達量分別在0.5 h、1 h和1.5 h達到高峰。Western bolt結果顯示,所制備的多克隆抗體可特異性識別河蟹凝血因子重組蛋白;對河蟹體內凝血因子蛋白的檢測發(fā)現:未處理的健康河蟹心臟、肝胰臟和血淋巴組織內凝血因子蛋白含量極少,而經嗜水氣單胞菌感染和斷肢后,對應組織中則大量表達該凝血因子蛋白。結論:我們克隆并鑒定了河蟹凝血因子,證明在無脊椎動物中也同樣存在凝血因子。凝血因子基因主要在河蟹心臟、肝臟和血淋巴組織中大量表達。在嗜水氣單胞菌感染和斷肢后,河蟹心臟、肝胰臟和血淋巴組織中凝血因子mRNA相對表達量顯著增加。Western blot結果顯示,健康河蟹機體內凝血因子蛋白含量極低,在受到嗜水氣單胞菌感染和斷肢刺激后在河蟹心臟、肝臟和血淋巴組織中凝血因子蛋白大量表達。本研究從mRNA水平及蛋白水平研究了河蟹在機體受到感染和刺激后體內凝血因子的表達特征,推測凝血因子在河蟹防御病原菌和自切反應過程中扮演重要角色。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2658001