發(fā)布時間：2020-05-10 15:22

【摘要】：仿刺參[Apojtichopus japonicus,(Selenka,1867)]是我國海洋重要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動物,長期以來我國仿刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)一直在北方地區(qū)開展,但目前仿刺參的人工養(yǎng)殖出現(xiàn)南移趨勢,隨著南方養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴(kuò)大,養(yǎng)殖管理的不規(guī)范,導(dǎo)致仿刺參爆發(fā)病害,其中,腐皮綜合征是目前南方仿刺參養(yǎng)殖過程中最常見的疾病。南方夏季水溫高,仿刺參免疫力下降,此時最易發(fā)病,在病害爆發(fā)時可導(dǎo)致大規(guī)模個體死亡,嚴(yán)重威脅著我國南方仿刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。本研究致力于明確南移養(yǎng)殖度夏仿刺參腐皮綜合征的病原菌,建立病原菌的快速鑒別技術(shù);同時結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)研究腐皮綜合征病原菌入侵仿刺參時的免疫防御機(jī)制,特別是分離腐皮綜合征病原菌誘導(dǎo)下的差異表達(dá)基因,了解其表達(dá)模式,探討腐皮綜合征病原菌的誘導(dǎo)和免疫相關(guān)基因的關(guān)系,為克隆免疫相關(guān)基因創(chuàng)造條件,深入闡述仿刺參的免疫防御機(jī)制和培育抗病新品種奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.從患有腐皮綜合征的度夏仿刺參上分離純化獲優(yōu)勢菌株,人工回接感染實驗驗證其為病原菌。利用注射感染和浸浴感染兩種方式了解該病原菌對仿刺參的致病性,發(fā)現(xiàn)兩種方式均能誘導(dǎo)發(fā)病,從而證明了本實驗分離的菌株對仿刺參具有較強(qiáng)致病性。綜合采用3種方法全面了解病原菌的特征并加以鑒定,確定該病原菌為伯麥羅弧菌(Vibrio pomeroyi Thompson etal,2003)。研究表明,基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)準(zhǔn)確、便捷、重復(fù)性高,非常適合于傳統(tǒng)鑒定方法易混淆的弧菌種類鑒別,可作為病原菌快速鑒別的方法。2.將本次實驗獲得的伯麥羅弧菌菌株V.pomeroyiSUS與分離自巴西海域的V.pomeroyi LMG20537T(典型菌株)以及分離自彼得大帝灣的V.pomeroyi 929進(jìn)行比較,結(jié)果表明來自不同海域的菌株對鹽度和溫度的耐受性與其生長的環(huán)境密切相關(guān),表現(xiàn)出不同海域間的明顯差異,其中采自夏季福建海域的V.pomeroyi SUS相對其他2個菌株對高溫具有較好的耐受性;來自于巴西圣卡塔琳娜州鹽度較高海域的的典型菌株V.pomeroyi LMG20537.T與另2株采集自鹽度相對較低海域(福建莆田、彼得大帝灣)的菌株相比,對鹽度具有較高的耐受性,能在含8%NaCl培養(yǎng)基上生長。3.采用抑制性消減雜交技術(shù),以仿刺參體內(nèi)承擔(dān)主要免疫作用的體腔細(xì)胞為材料,構(gòu)建了仿刺參經(jīng)伯麥羅弧菌誘導(dǎo)的抑制性差減雜交cDNA文庫。文庫中的808個陽性克隆提取質(zhì)粒后測序,共得到806條高質(zhì)量序列,聚類后共獲得318個unigene。對基因進(jìn)行GO分類,發(fā)現(xiàn)GO分類為生物過程的unigene數(shù)量最多,細(xì)胞組分和分子功能的unigene數(shù)量比較持平。在細(xì)胞組分注釋類別下,以細(xì)胞組成(cellpart)最多;在分子功能類中蛋白質(zhì)結(jié)合功能(protein binding)最多;而在生物過程中,生物學(xué)調(diào)節(jié)過程(regulation of biological process)是包含差異基因最多的類別。4.據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果,篩選出C型凝集素(contig116和contig17)、含鐵蛋白(B07和H0 1)和血清樣淀粉蛋白A(contig96)5個與免疫相關(guān)的ESTs。利用熒光實時定量PCR技術(shù)研究仿刺參5個ESTs在伯麥羅弧菌誘導(dǎo)下的差異表達(dá),結(jié)果表明:C型凝集素由于種類不同,在病原菌誘導(dǎo)后在體腔細(xì)胞中隨時間推移其表達(dá)量的變化模式不同;但在病原菌誘導(dǎo)后24h,兩者在不同組織/器官中的表達(dá)分布模式比較一致,均在體腔細(xì)胞中表達(dá)量最高,體壁組織中表達(dá)量最低,contig17在體壁組織中甚至沒有表達(dá)。血清淀粉樣蛋白A在病原菌誘導(dǎo)后24h出現(xiàn)上調(diào),48h轉(zhuǎn)而下降,根據(jù)該蛋白的特性,我們可推斷伯麥羅弧菌誘導(dǎo)48h后已不屬于仿刺參對病原菌反應(yīng)的急性期。含鐵蛋白包括鐵蛋白(B07)和核糖核苷酸還原酶(H01),前者于病原菌誘導(dǎo)后在呼吸樹中的表達(dá)量最高;后者則在體腔細(xì)胞中表達(dá)量最高,呼吸樹次之。兩者在病原菌誘導(dǎo)后時間序列上的表達(dá)模式也不同,鐵蛋白在24h出現(xiàn)下調(diào),而核糖核苷酸還原酶卻在24h出現(xiàn)上調(diào)�？梢姾F蛋白不僅具有氧的運輸和電子轉(zhuǎn)運功能,同時也與免疫防御息息相關(guān)。
【圖文】：

ｉ窗２３ＳｉＨＫＡ護(hù)瓠？片《」逡逑Ｊ．邋２１－３８．邋６１邋１ＪＪ－Ｉ３２：邋１：邋Ｉ８Ｓ－２３Ｓ．邐＜Ｃ２￣＜３７邋９．邋４４｜－４ａ）邋ＪＣ，４５６￣４Ｗ逡逑圖１－２細(xì)菌１６Ｓ？２３ＳｒＲＮＡ基因（ＩＴＳ）的結(jié)構(gòu)（李鵬等，２００８）逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋１６Ｓ－２３Ｓ邋ｒＲＮＡ邋（ＩＴＳ）逡逑細(xì)菌的１６ＳｒＲＮＡ基因全長約為１．５邋Ｋｂ，在目前的測序技術(shù)下，該長度非常適逡逑于測序；具有多個保守區(qū)域，并且和變異片段兩者互相交錯排列，保守性可反映逡逑物種之間的親緣關(guān)系，高變性則揭示不同菌屬之間的差異，是屬種鑒定的分子基逡逑礎(chǔ)（Ｒｅｉｍａｎ，１９９９）。逡逑研[傊惺紫然竦檬笛槎韻蟮模保叮渝澹潁遙危列蛄行畔�，再利用n蹋粒櫻緣裙ぞ哂爰哄義現(xiàn)諳呤菘庵械男蛄行畔⒔釁ヅ洌ê橐騫齲玻埃埃玻誨澹茫歟幔潁潁椋洌紓澹澹簦幔歟澹玻埃埃矗哄義戲胂嫉齲玻埃埃擔(dān)�。磦蝤可有效抵\榷猿鑫粗艫木輳�，臍ぐ可提供１６Ｓ邋}遙危鈴義匣蛐蛄薪斜榷緣氖菘獍ǎ海牽澹睿攏幔睿牘彩菘�、秧ａ}簦牽澹睿迨菘夂灣義希停椋悖潁錚櫻澹襠桃禱菘獾榷喔鍪萏峁┬蛄欣叢礎(chǔ)＃牽澹睿攏幔睿朧菘饈褂寐首罡

本文編號：2657506