【摘要】：前期研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)小分子SP600125能夠誘導(dǎo)魚類細(xì)胞發(fā)生多倍化并成功獲得穩(wěn)定的同源四倍體鯽魚細(xì)胞系。為進(jìn)一步了解SP600125誘導(dǎo)魚類細(xì)胞多倍化的分子機(jī)制,本研究通過RNA-seq方法獲取SP600125處理組和對照組細(xì)胞的差異基因表達(dá)譜,利用GO和KEGG通路富集分析全面挖掘SP600125誘導(dǎo)細(xì)胞多倍化和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持相關(guān)的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵功能基因,旨在揭示SP600125誘導(dǎo)魚類細(xì)胞多倍化的作用機(jī)制,以期為SP600125在魚類發(fā)育生物學(xué)的研究以及多倍體培育中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。具體結(jié)果如下:1.高通量測序分析SP600125處理細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組水平的變化采用高通量測序技術(shù),對體外培養(yǎng)的二倍體鯽尾鰭細(xì)胞和SP600125處理組細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和比較分析。獲得96,997個(gè)unigenes并對unigenes進(jìn)行了GO功能注釋和KEGG通路富集分析。比較SP600125處理組與對照組共獲得差異表達(dá)基因4516個(gè),其中顯著上調(diào)有2670個(gè),顯著下調(diào)有1846個(gè)。差異基因主要與細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)、發(fā)育過程以及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)。結(jié)果顯示SP600125誘導(dǎo)引起一批細(xì)胞增殖調(diào)控相關(guān)功能基因尤其以細(xì)胞周期檢測點(diǎn)相關(guān)基因表達(dá)水平的改變最為突出,表明SP600125對細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的多重調(diào)控與其實(shí)現(xiàn)魚類細(xì)胞多倍化的誘導(dǎo)密切相關(guān)。2.p53信號(hào)通路對SP600125誘導(dǎo)細(xì)胞多倍化的調(diào)控作用基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的結(jié)果,進(jìn)一步鑒定了與細(xì)胞周期檢測點(diǎn)密切相關(guān)的p53信號(hào)通路在SP600125誘導(dǎo)細(xì)胞多倍化中的作用。根據(jù)已建立的SP600125誘導(dǎo)多倍化的間隔循環(huán)策略,利用qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測SP600125處理對p53信號(hào)通路相關(guān)基因的mRNA和蛋白水平的影響,結(jié)果表明SP600125誘導(dǎo)引起p53、Mdm2、p21和Gadd45ɑ等細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)功能基因的mRNA表達(dá)水平產(chǎn)生顯著上調(diào),這與轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果具有一致性;Western blot結(jié)果亦表明SP600125處理48h后細(xì)胞中的p53、MDM2和p21的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。為進(jìn)一步驗(yàn)證p53通路在SP600125誘導(dǎo)細(xì)胞多倍體中的作用,以p53抑制劑PFT-ɑ孵育細(xì)胞,結(jié)果顯示PFT-ɑ處理可以在一定程度上降低SP600125對細(xì)胞周期G_2/M期的阻滯和減少多倍體細(xì)胞的產(chǎn)生。以上結(jié)果表明p53通路通過調(diào)控細(xì)胞周期發(fā)生G_2/M期阻滯參與SP600125誘導(dǎo)魚類細(xì)胞多倍化的產(chǎn)生。3.紡錘體檢測點(diǎn)(SAC)基因?qū)P600125誘導(dǎo)細(xì)胞多倍化的影響細(xì)胞學(xué)觀察顯示經(jīng)SP600125處理導(dǎo)致細(xì)胞停滯于有絲分裂期。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果均表明SP600125導(dǎo)致細(xì)胞CyclinBl/3、Cdc2、Securin以及負(fù)責(zé)與動(dòng)點(diǎn)粘附和對染色體分離監(jiān)控的紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)(SAC)相關(guān)基因Bub1、Mad2和Cdc20的mRNA水平呈下調(diào)性變化。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)SP600125誘導(dǎo)引起細(xì)胞中的BUB1、MAD2和CDC20蛋白的表達(dá)水平下降。利用腺病毒成功構(gòu)建了紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)(SAC)核心蛋白MAD2的過表達(dá)重組載體(pAd-mCMV-MAD2-3-Flag-GFP-pA)。結(jié)合qRT-PCR、Western blot技術(shù)以及流式細(xì)胞儀分析,進(jìn)一步鑒定了過表達(dá)MAD2對SP600125誘導(dǎo)細(xì)胞多倍化的影響。結(jié)果證實(shí)過表達(dá)MAD2能明顯減弱SP600125間隔循環(huán)處理所引起細(xì)胞多倍體的發(fā)生。以上結(jié)果表明經(jīng)SP600125誘導(dǎo)引起CyclinBl-Cdc2復(fù)合物和紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)(SAC)活力下降導(dǎo)致有絲分裂滑移和核內(nèi)有絲分裂共同產(chǎn)生細(xì)胞多倍化。4.急性免疫應(yīng)激參與SP600125脅迫下的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持調(diào)節(jié)基于轉(zhuǎn)錄組測序分析,二倍體鯽尾鰭細(xì)胞經(jīng)SP600125處理后能夠引起大量免疫炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)生顯著的改變,其中涉及到參與先天防御、炎癥途徑和細(xì)胞粘附分子相關(guān)途徑包括促炎細(xì)胞因子(如IL-1β、TNF-ɑ和IL-6R)、轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(如Stat-1/3和IκB)、細(xì)胞粘附分子(如Vcam-1)和整合素(ɑ2β1和ɑMβ2)等。同時(shí)SP600125處理導(dǎo)致線粒體不僅在形態(tài)和數(shù)量發(fā)生明顯改變而且在Glut1和主要糖酵解酶基因(如Hk1、Pfbfk、Pgam、Eno和Ldh)的mRNA水平顯著降低以及線粒體電子傳遞鏈基因(如NADH脫氫酶的Nd1、Nd2和Nd5復(fù)合體I亞基基因、Adh、Ndufs8、Ndufa4、Uqcr和Sdhd等)的mRNA水平也顯著下調(diào)。相關(guān)研究結(jié)果揭示了在SP600125的脅迫下細(xì)胞通過應(yīng)激免疫響應(yīng)和降低氧化磷酸化水平等措施參與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。結(jié)論:(1)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明SP600125對細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的多重調(diào)控與其實(shí)現(xiàn)魚類細(xì)胞多倍化的誘導(dǎo)密切相關(guān)。(2)SP600125誘導(dǎo)增強(qiáng)了p53信號(hào)通路的G_2/M期阻滯并導(dǎo)致紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)(SAC)信號(hào)削弱引發(fā)的有絲分裂滑移和核內(nèi)有絲分裂從而實(shí)現(xiàn)魚類細(xì)胞多倍化。(3)在SP600125脅迫下細(xì)胞通過應(yīng)激免疫響應(yīng)和降低氧化磷酸化水平等措施參與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。研究結(jié)果為SP600125在魚類發(fā)育生物學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 真核生物中存在的多倍體[9]植物(綠色)、動(dòng)物(藍(lán)色)和真菌(黃色)多倍體的演化過程。紅點(diǎn)表示支持的全基因組復(fù)制事件；黃點(diǎn)表示推測的整個(gè)基因組復(fù)制事件。Figure 1-1 Polyploidy in eukaryotes. polyploidyzation events occurred in the evolution of plants(green)animals(blue)and fungi(yellow). Well-supported whole genome duplication events areindicated by a red dot. Yellow dots indicate speculated whole genome duplication events.在正常生理發(fā)育過程中，多倍體細(xì)胞的產(chǎn)生與其發(fā)育和終端分化、物質(zhì)儲(chǔ)存和吸收、機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持且具有較強(qiáng)的可塑性，此外在代謝壓力以及抵御不良環(huán)境等細(xì)胞應(yīng)激(如在衰老、高血壓和傷口愈合)條件下而產(chǎn)生多倍體細(xì)胞來增強(qiáng)新陳代謝以其來更好地適應(yīng)各種應(yīng)激[20-22]。在肝臟中多倍體細(xì)胞存在的比例與年齡的增長、氧化應(yīng)激、端�？s短及肝臟切除術(shù)后的肝細(xì)胞再生有關(guān)[23-24]。普遍認(rèn)為個(gè)體中這些多倍體細(xì)胞的出現(xiàn)可以保護(hù)細(xì)胞基因組不被損毀，同時(shí)也是抵抗各種損傷、毒性物質(zhì)的選擇性結(jié)果[25]。

SP600125 誘導(dǎo)魚類細(xì)胞多倍化的分子機(jī)制研究1.2 多倍體細(xì)胞形成的機(jī)制細(xì)胞對 DNA 損傷的應(yīng)激響應(yīng)主要是通過細(xì)胞周期檢查點(diǎn)(cell cyclecheckpoint)來激活細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并將細(xì)胞周期阻滯在其中的某個(gè)時(shí)期，，給細(xì)胞留出足夠的時(shí)間進(jìn)行 DNA 修復(fù)損傷直到修復(fù)完成時(shí)，才會(huì)進(jìn)入下一個(gè)時(shí)期來避免將受損的基因復(fù)制遺傳給下一代，這樣有利于維持基因組的穩(wěn)定性和細(xì)胞的存活[26]。根據(jù)在細(xì)胞周期中的時(shí)間順序?qū)⒓?xì)胞周期檢查點(diǎn)主要分為 G1/S 檢查點(diǎn)、G2/M 檢查點(diǎn)、中后期檢查點(diǎn)(紡錘體組裝檢查點(diǎn))，它們分別負(fù)責(zé)查看有無DNA 損傷，DNA 復(fù)制錯(cuò)誤和染色體是否正確分配，在如此這樣的一套精細(xì)的調(diào)控機(jī)制下來確保細(xì)胞周期各時(shí)相有序的進(jìn)行[26](圖 1-2)。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2638839