【摘要】：前期研究發(fā)現(xiàn)化學小分子SP600125能夠誘導魚類細胞發(fā)生多倍化并成功獲得穩(wěn)定的同源四倍體鯽魚細胞系。為進一步了解SP600125誘導魚類細胞多倍化的分子機制,本研究通過RNA-seq方法獲取SP600125處理組和對照組細胞的差異基因表達譜,利用GO和KEGG通路富集分析全面挖掘SP600125誘導細胞多倍化和細胞穩(wěn)態(tài)維持相關(guān)的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵功能基因,旨在揭示SP600125誘導魚類細胞多倍化的作用機制,以期為SP600125在魚類發(fā)育生物學的研究以及多倍體培育中的應用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。具體結(jié)果如下:1.高通量測序分析SP600125處理細胞全轉(zhuǎn)錄組水平的變化采用高通量測序技術(shù),對體外培養(yǎng)的二倍體鯽尾鰭細胞和SP600125處理組細胞進行了轉(zhuǎn)錄組測序和比較分析。獲得96,997個unigenes并對unigenes進行了GO功能注釋和KEGG通路富集分析。比較SP600125處理組與對照組共獲得差異表達基因4516個,其中顯著上調(diào)有2670個,顯著下調(diào)有1846個。差異基因主要與細胞代謝、應激反應、發(fā)育過程以及細胞周期調(diào)控相關(guān)。結(jié)果顯示SP600125誘導引起一批細胞增殖調(diào)控相關(guān)功能基因尤其以細胞周期檢測點相關(guān)基因表達水平的改變最為突出,表明SP600125對細胞周期檢驗點的多重調(diào)控與其實現(xiàn)魚類細胞多倍化的誘導密切相關(guān)。2.p53信號通路對SP600125誘導細胞多倍化的調(diào)控作用基于轉(zhuǎn)錄組學分析的結(jié)果,進一步鑒定了與細胞周期檢測點密切相關(guān)的p53信號通路在SP600125誘導細胞多倍化中的作用。根據(jù)已建立的SP600125誘導多倍化的間隔循環(huán)策略,利用qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測SP600125處理對p53信號通路相關(guān)基因的mRNA和蛋白水平的影響,結(jié)果表明SP600125誘導引起p53、Mdm2、p21和Gadd45ɑ等細胞周期調(diào)控相關(guān)功能基因的mRNA表達水平產(chǎn)生顯著上調(diào),這與轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果具有一致性;Western blot結(jié)果亦表明SP600125處理48h后細胞中的p53、MDM2和p21的蛋白表達明顯上調(diào)。為進一步驗證p53通路在SP600125誘導細胞多倍體中的作用,以p53抑制劑PFT-ɑ孵育細胞,結(jié)果顯示PFT-ɑ處理可以在一定程度上降低SP600125對細胞周期G_2/M期的阻滯和減少多倍體細胞的產(chǎn)生。以上結(jié)果表明p53通路通過調(diào)控細胞周期發(fā)生G_2/M期阻滯參與SP600125誘導魚類細胞多倍化的產(chǎn)生。3.紡錘體檢測點(SAC)基因?qū)P600125誘導細胞多倍化的影響細胞學觀察顯示經(jīng)SP600125處理導致細胞停滯于有絲分裂期。轉(zhuǎn)錄組學分析和qRT-PCR驗證結(jié)果均表明SP600125導致細胞CyclinBl/3、Cdc2、Securin以及負責與動點粘附和對染色體分離監(jiān)控的紡錘體檢驗點(SAC)相關(guān)基因Bub1、Mad2和Cdc20的mRNA水平呈下調(diào)性變化。Western blot結(jié)果進一步證實SP600125誘導引起細胞中的BUB1、MAD2和CDC20蛋白的表達水平下降。利用腺病毒成功構(gòu)建了紡錘體檢驗點(SAC)核心蛋白MAD2的過表達重組載體(pAd-mCMV-MAD2-3-Flag-GFP-pA)。結(jié)合qRT-PCR、Western blot技術(shù)以及流式細胞儀分析,進一步鑒定了過表達MAD2對SP600125誘導細胞多倍化的影響。結(jié)果證實過表達MAD2能明顯減弱SP600125間隔循環(huán)處理所引起細胞多倍體的發(fā)生。以上結(jié)果表明經(jīng)SP600125誘導引起CyclinBl-Cdc2復合物和紡錘體檢驗點(SAC)活力下降導致有絲分裂滑移和核內(nèi)有絲分裂共同產(chǎn)生細胞多倍化。4.急性免疫應激參與SP600125脅迫下的細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持調(diào)節(jié)基于轉(zhuǎn)錄組測序分析,二倍體鯽尾鰭細胞經(jīng)SP600125處理后能夠引起大量免疫炎癥相關(guān)基因表達水平發(fā)生顯著的改變,其中涉及到參與先天防御、炎癥途徑和細胞粘附分子相關(guān)途徑包括促炎細胞因子(如IL-1β、TNF-ɑ和IL-6R)、轉(zhuǎn)錄因子信號轉(zhuǎn)導分子(如Stat-1/3和IκB)、細胞粘附分子(如Vcam-1)和整合素(ɑ2β1和ɑMβ2)等。同時SP600125處理導致線粒體不僅在形態(tài)和數(shù)量發(fā)生明顯改變而且在Glut1和主要糖酵解酶基因(如Hk1、Pfbfk、Pgam、Eno和Ldh)的mRNA水平顯著降低以及線粒體電子傳遞鏈基因(如NADH脫氫酶的Nd1、Nd2和Nd5復合體I亞基基因、Adh、Ndufs8、Ndufa4、Uqcr和Sdhd等)的mRNA水平也顯著下調(diào)。相關(guān)研究結(jié)果揭示了在SP600125的脅迫下細胞通過應激免疫響應和降低氧化磷酸化水平等措施參與細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。結(jié)論:(1)轉(zhuǎn)錄組學分析表明SP600125對細胞周期檢驗點的多重調(diào)控與其實現(xiàn)魚類細胞多倍化的誘導密切相關(guān)。(2)SP600125誘導增強了p53信號通路的G_2/M期阻滯并導致紡錘體檢驗點(SAC)信號削弱引發(fā)的有絲分裂滑移和核內(nèi)有絲分裂從而實現(xiàn)魚類細胞多倍化。(3)在SP600125脅迫下細胞通過應激免疫響應和降低氧化磷酸化水平等措施參與細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。研究結(jié)果為SP600125在魚類發(fā)育生物學研究和生產(chǎn)實踐中的應用奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 真核生物中存在的多倍體[9]植物(綠色)、動物(藍色)和真菌(黃色)多倍體的演化過程。紅點表示支持的全基因組復制事件；黃點表示推測的整個基因組復制事件。Figure 1-1 Polyploidy in eukaryotes. polyploidyzation events occurred in the evolution of plants(green)animals(blue)and fungi(yellow). Well-supported whole genome duplication events areindicated by a red dot. Yellow dots indicate speculated whole genome duplication events.在正常生理發(fā)育過程中，多倍體細胞的產(chǎn)生與其發(fā)育和終端分化、物質(zhì)儲存和吸收、機體穩(wěn)態(tài)維持且具有較強的可塑性，此外在代謝壓力以及抵御不良環(huán)境等細胞應激(如在衰老、高血壓和傷口愈合)條件下而產(chǎn)生多倍體細胞來增強新陳代謝以其來更好地適應各種應激[20-22]。在肝臟中多倍體細胞存在的比例與年齡的增長、氧化應激、端�？s短及肝臟切除術(shù)后的肝細胞再生有關(guān)[23-24]。普遍認為個體中這些多倍體細胞的出現(xiàn)可以保護細胞基因組不被損毀，同時也是抵抗各種損傷、毒性物質(zhì)的選擇性結(jié)果[25]。

SP600125 誘導魚類細胞多倍化的分子機制研究1.2 多倍體細胞形成的機制細胞對 DNA 損傷的應激響應主要是通過細胞周期檢查點(cell cyclecheckpoint)來激活細胞的信號轉(zhuǎn)導途徑并將細胞周期阻滯在其中的某個時期，，給細胞留出足夠的時間進行 DNA 修復損傷直到修復完成時，才會進入下一個時期來避免將受損的基因復制遺傳給下一代，這樣有利于維持基因組的穩(wěn)定性和細胞的存活[26]。根據(jù)在細胞周期中的時間順序?qū)⒓毎芷跈z查點主要分為 G1/S 檢查點、G2/M 檢查點、中后期檢查點(紡錘體組裝檢查點)，它們分別負責查看有無DNA 損傷，DNA 復制錯誤和染色體是否正確分配，在如此這樣的一套精細的調(diào)控機制下來確保細胞周期各時相有序的進行[26](圖 1-2)。
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2638839