【摘要】：尼羅羅非魚(Niletilapia，Oreochroms Niloticus)由于具有生長速度快、肉質(zhì)鮮美、繁殖能力強等特點,近幾十年來,其生產(chǎn)得到了迅速發(fā)展,但隨著高密度化的養(yǎng)殖,魚類不斷受到多種微生物的入侵,造成魚群的大量死亡,與之相比魚類病害的防治幾乎停留在化學(xué)治療時期。目前很多研究證實:魚類是有頜類脊椎動物中最早具有比較完整免疫系統(tǒng)的種群,其中免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是魚類體液免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)分子,因此對魚類Ig研究不僅能為魚類免疫學(xué)、遺傳學(xué)的研究和認(rèn)識脊椎動物免疫系統(tǒng)的進化規(guī)律提供一定的理論基礎(chǔ),同時也能為魚類病害的免疫防治提供理論依據(jù)。本文經(jīng)過分析尼羅羅非魚性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及利用RACE技術(shù)得到了尼羅羅非魚sIgM、mlgT重鏈cDNA全長。其中sIgMcDNA全長為1919bp，，5'非編碼區(qū)包含233bp,3'非編碼區(qū)有140bp,包含加尾信號(AATAAA)和poly(A),開放閱讀框則包含1545 bp,編碼514個氨基酸,分為5個功能區(qū),1個可變區(qū)和4個恒定區(qū)。多序列比對發(fā)現(xiàn)V區(qū)由2個骨架區(qū)FR3、FR4和2個互補決定區(qū)CDR2、CDR3組成。FR3中存在重鏈可變區(qū)Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ家族保守區(qū)域YYCAR，F(xiàn)R4中存在V家族的保守區(qū)域FDYWGKGT-VTV-S,4個恒定區(qū)存在保守的半胱氨酸、色氨酸位點,CH3中還存在功能不明確Phe/Tyr-X-Cys-X-Val-X-His和C1q結(jié)合的His-X-Asp-X-X-X-Pro 保守區(qū)域。而mIgTcDNA全長為 1759bp，5'非編碼區(qū)包含29bp，3'非編碼區(qū)有209bp,包含加尾信號(AATAAA)和poly(A),開放閱讀框包含1521bp,編碼506個氨基酸,分為4個功能區(qū):1個可變區(qū)和3個恒定區(qū)�？勺儏^(qū)由1個前導(dǎo)鏈、4個骨架區(qū)(FR1、FR2、FR3、FR4)和 3 個高變區(qū)(CDR1、CDR2、CDR3)組成。而3個恒定區(qū)分別為τ1、和τ4,缺少τ3恒定區(qū),且τ1的基因座與IgM中μ1的基因座一致，τ2和τ4位于μ1基因座的上游。此外跨膜區(qū)存在疏水性、親水性氨基酸組成的CART(conserved antigen receptor transmembrane)。在進化樹分析中IgT與紅鰭東方渶(Takifugu rubripes)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)和鱖(Siniperca chuatsi)IgT/Z聚為一枝,而IgM與南極魚(Chaenocephalus aceratus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)和鱖IgM聚為一枝。不同發(fā)育時期RT-PCR檢測結(jié)果顯示:IgM在受精初期的表達量較低,基本檢測不到表達,在受精后25 d整魚中檢測到明顯表達,而IgT在受精后8 d魚中就能檢測到表達,且IgM、IgT的表達量隨魚的發(fā)育呈上升趨勢。各組織RT-PCR結(jié)果表明,IgM主要在4月齡、6月齡魚的頭腎、腸及脾臟中表達,其次在腦、腎、皮膚、卵巢、精巢及鰓中表達,而IgT主要在4月齡、6月齡魚的頭腎、脾臟中表達。嗜水氣單孢菌刺激尼羅羅非魚后,不同組織的qPCR檢測結(jié)果表明:IgT在腸、脾臟、鰓、腎、頭腎中的表達分別在刺激后2d、1d、Id、2d、Id顯著性增強,在皮膚中的表達沒有明顯增強;而IgM則在刺激后7 d、7 d、7 d、12 h的皮膚、鰓、腎、頭腎中的表達顯著性增強,腸中的表達量基本一直處于對照水平。通過原核表達載體PSUMO、PET-28a,分別構(gòu)建了 PSUMO-IgMCH2-4、PET-28a-IgT CH2-3、PSUMO-IgT CH3 重組質(zhì)粒,利用 IPTG 在大腸桿菌 BL21 分別誘導(dǎo)出以包涵體形式大量表達的目的蛋白。以純化后的IgM CH2-4、PET-28a-IgT CH2-3蛋白為抗原,免疫6-8周齡Balb/c雌性小鼠制備抗體。ELISA測定抗血清效價分別為1:20000、1:40000。間接ELISA檢測重組蛋白IgM抗體識別表位結(jié)果顯示:該抗體只能與尿素處理的尼羅羅非魚全血清發(fā)生反應(yīng);Westem blotting結(jié)果表明:抗血清不僅能識別重組蛋白IgM,而且能與尼羅羅非魚全血清中分子量為76.6kDa的蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。此外還用細胞融合技術(shù)制備了抗IgT的單克隆抗體,最終篩選到一株能穩(wěn)定分泌抗IgT CH3抗體的雜交瘤細胞株G9-B5。本研究制備的抗體為進一步了解尼羅羅非魚B細胞類型、特性及功能奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

４．４實驗結(jié)果逡逑４．４．１尼羅羅非魚ＩｇＭ、ＩｇＴ邋ＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果逡逑不同發(fā)育時期ＲＴ－ＰＣＲ檢測結(jié)果顯示（圖４．１ａ）邋：邋ＩｇＭ在受精初期的表達量比逡逑較低，基本檢測不到表達，在受精后２５邋ｄ整魚中明顯檢測到表達，而ＩｇＴ在受精逡逑２７逡逑

５．４．１尼羅羅非魚ＩｇＭ邋ＣＨ２－４重組蛋白的誘導(dǎo)及純化逡逑尼羅羅非魚ＰＳＵＭＯ－ＩｇＭ邋ＣＨ２－４重組菌體總蛋白經(jīng)１２邋％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，結(jié)果逡逑如圖５．１所示。結(jié)果表明：在ＩＰＴＧ誘導(dǎo)下，大腸桿菌菌體總蛋白中出現(xiàn)一條目的逡逑ｋＤ邐Ｍ邋１邐２邐３邐４邐５邐６逡逑１１６邋一逡逑６６．２邐—逡逑４５．０邐一~k＿逡逑３５．０邐—＾邐：逡逑２５．０邐—邋＝逡逑１８．４邐．一運邐？邐—逡逑１４邋４逡逑圖５．］邋ＩｇＭ重組蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ圖逡逑Ｆｉｇ．５．１邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ＩｇＭ逡逑Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；邋１．未誘導(dǎo)菌體總蛋白；２．誘導(dǎo)菌體總蛋白；３、４．誘導(dǎo)后破菌上清、沉淀；５．純化重組蛋白；６．ＵＬＰ１逡逑Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；邋１．ｔｏｔａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｆｒｏｍ邋ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ邋ＰＳＵＭＯ－ＩｇＭ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ＢＬ２１；邋２．ｔｏｔａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｆｒｏｍ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＰＳＵＭＯ－ＩｇＭ逡逑ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ＢＬ２１；邋３＆４．ｓｕｐｅｍａｔｅ邋ａｎｄ邋ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｆｒｏｍ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＰＳＵＭＯ－ＩｇＭ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ＢＬ２１；邋５．ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ逡逑ｐｒｏｔｅｉｎ；邋６．ＵＬＰ１逡逑條帶，且該條帶的分子量與理論估計的相對分子量大�。担埃板澹耄模嵯喾欢凑T導(dǎo)的逡逑菌體總蛋白無明顯的重組目的蛋白表達。未誘導(dǎo)組與誘導(dǎo)組比較
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2636600