【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹是我國著名的淡水蟹。它體大、營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美經(jīng)濟價值極高。中華絨螯蟹主要分布于長江中下游及沿海各省,具有生殖洄游的習(xí)性,每年秋冬之交,性成熟的個體沿江洄游到河口入海處的咸淡水交匯區(qū)交配產(chǎn)卵,幼體在咸淡水中發(fā)育成幼蟹,然后溯河而上,經(jīng)過多次蛻殼,成蟹在淡水中生長。中華絨螯蟹在洄游過程中,環(huán)境鹽度發(fā)生了劇烈的變化,環(huán)境鹽度對中華絨螯蟹的性腺成熟和生殖洄游有重要的影響。中華絨螯蟹能依靠自身特殊的滲透壓調(diào)節(jié)機理適應(yīng)外界鹽度的變化,為更加清楚的認識中華絨螯蟹的滲透壓調(diào)節(jié),本研究通過運用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),初步探究了短期高鹽度脅迫下中華絨螯蟹雄性成蟹后鰓組織的基因轉(zhuǎn)錄水平表達和蛋白質(zhì)表達情況,綜合分析了高鹽度脅迫下中華絨螯蟹后鰓組織中的能量代謝、信息傳導(dǎo)、離子轉(zhuǎn)運、免疫應(yīng)激、氨基酸代謝、脂肪酸代謝、細胞骨架蛋白等生物學(xué)過程;基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,挖掘出與中華絨螯蟹滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)的重要離子通道蛋白鈉鉀氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(NKCC),通過基因克隆技術(shù)獲得NKCC基因的全長,并且分析了其在中華絨螯蟹不同組織、不同鹽度以及不同鹽度脅迫時間條件下的表達情況。1.急性高鹽度脅迫下中華絨螯蟹后鰓的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析為揭示與中華絨螯蟹滲透調(diào)節(jié)有關(guān)的基因和通路,將雄性成蟹(體重=110±5 g)分別在淡水(FW,0 ppt)和海水(SW,25 ppt)中馴化144h。用RNA-Seq技術(shù)分析了蟹后鰓轉(zhuǎn)錄組的變化,共獲得了174903個unigene。通過對FW組和SW組轉(zhuǎn)錄基因的比較,共發(fā)現(xiàn)932個差異基因,包括433個上調(diào)基因和499個下調(diào)基因。GO富集分析表明,與鹽脅迫相關(guān)的一些重要的生物學(xué)過程被顯著富集,包括能量代謝、離子轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗氧化活性。KEGG富集分析將差異表達的基因富集到241個特定的代謝途徑,其中與能量代謝、氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)相關(guān)的途徑被顯著富集。高鹽度脅迫改變了參與能量代謝、離子轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗氧化途徑的酶的表達,包括檸檬酸合成酶(CS)、Na~+/K~+-ATPase(NKA)、NKCC、多巴胺受體D1(DRD1)、突觸結(jié)合蛋白1(STXBP1)、Cu~(2+)/Zn~(2+)超氧化物歧化酶(SOD1)和谷胱氨酸S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。實驗所獲得的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為中華絨螯蟹新基因的鑒定和生理分析提供了理論基礎(chǔ)。2.急性高鹽度脅迫下中華絨螯蟹后鰓的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析實驗一運用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)比較了中華絨螯蟹在高鹽度脅迫的生理條件下鰓細胞內(nèi)所有mRNA的表達差異。蛋白質(zhì)是機體行使細胞功能的主要物質(zhì)承擔(dān)者,蛋白質(zhì)組能對特定生理條件下的細胞功能和狀態(tài)做最直接的描述,因此在實驗一的基礎(chǔ)上,實驗二分析了高鹽度脅迫后中華絨螯蟹鰓蛋白質(zhì)表達的變化情況。運用label free蛋白組技術(shù),共鑒定出了1453個蛋白,在2倍差異倍數(shù)(FC)閾值條件下,進行差異蛋白篩選,共鑒定出242個差異蛋白,包括122個上調(diào)差異蛋白和120個下調(diào)差異蛋白。運用GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫將差異蛋白進行注釋和富集,發(fā)現(xiàn)差異蛋白在能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子轉(zhuǎn)運、肌動蛋白細胞骨架、免疫、脂類代謝、氨基酸代謝等生物學(xué)功能中顯著富集。結(jié)果表明,在經(jīng)過144h的高鹽度脅迫后,中華絨螯蟹能量代謝降低,肌動蛋白和細胞骨架蛋白表達增強。在高鹽度脅迫下,中華絨螯蟹通過提高免疫和抗氧化能力來應(yīng)對高鹽度產(chǎn)生的氧化損傷。3.中華絨螯蟹NKCC基因的克隆和表達分析NKCC是運輸Na~+、K~+和Cl~-的SLC12家族蛋白,在水生動物離子轉(zhuǎn)運和滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本實驗運用RT-PCR和RACE技術(shù)從中華絨螯蟹后鰓中克隆了NKCC基因;該基因的cDNA全長為4127bp,其中5'非編碼區(qū)(UTR)長度為18 bp,3'非編碼區(qū)長度為944bp,開放閱讀框(ORF)長度為3165bp,編碼1054個氨基酸。理化分析預(yù)測其分子量為51.066 kD,理論等電點為4.65。預(yù)測中華絨螯蟹NKCC二級結(jié)構(gòu)由12個跨膜結(jié)構(gòu)域組成,同源對比結(jié)果顯示,中華絨螯蟹NKCC的氨基酸序列與擬穴青蟹(Scylla paramamosain)NKCC相似度最高,為86.17%。系統(tǒng)進化分析表明中華絨螯蟹NKCC與擬穴青蟹,三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus),可口美青蟹(Callinectes sapidus),藍蟹(Callinectes sapidus)聚為一支。運用實時熒光定量(qRT-PCR)對中華絨螯蟹NKCC進行組織定量結(jié)果表明,NKCC在中華絨螯蟹的鰓、肝胰腺、胃、心臟、腸、血清、眼柄、胸神經(jīng)結(jié)、腦神經(jīng)結(jié)中均有表達,NKCC在中華絨螯蟹腸的表達量最高。在25鹽度急性脅迫時,NKCC在中華絨螯蟹腸中的表達量隨著脅迫時間延長變化顯著,并在脅迫72h后恢復(fù)穩(wěn)定,表明其參與了中華絨螯蟹滲透壓調(diào)節(jié),并在河蟹的滲透壓平衡中發(fā)揮重要作用。本結(jié)果為進一步研究離子通道在中華絨螯蟹滲透調(diào)節(jié)的作用機制提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4

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本文編號：2627659