【摘要】：咽側(cè)體抑制素(Allatostatin,AST)是一類(lèi)存在于昆蟲(chóng)中能夠抑制咽側(cè)體合成保幼激素(Juvenile hormone,JH)的多效神經(jīng)肽。根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)該神經(jīng)肽家族分為三種類(lèi)型,分別為:A-typeAST(AST-A)、B-typeAST(AST-B)、C-type AST(AST-C)。在昆蟲(chóng)中,AST家族神經(jīng)肽有多種生物學(xué)功能,其中一個(gè)重要的功能是能夠影響生殖過(guò)程。迄今,AST在甲殼動(dòng)物中的研究尚少,尤其在生殖作用機(jī)制方面更是鳳毛麟角。為了探究AST-A對(duì)甲殼動(dòng)物生殖過(guò)程的影響,本研究采用qRT-PCR、RACE、原位雜交、體外培養(yǎng)、RNA干擾等技術(shù),從擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)中獲得SpAST-A 和其受體SpAST-AR 的cDNA 片段,運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了SpAST-A基因在擬穴青蟹中的組織分布、在不同發(fā)育期腦神經(jīng)節(jié)中和不同發(fā)育期卵巢中的表達(dá)譜,以及SpAST-AR在不同發(fā)育期卵巢中的表達(dá)差異;運(yùn)用原位雜交技術(shù),對(duì)SpAST-A和SpAST-AR在腦神經(jīng)節(jié)和卵巢中進(jìn)行定位;體外培養(yǎng)添加SpAST-A,運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)卵巢相關(guān)基因的表達(dá)譜;運(yùn)用RNA干擾技術(shù),體外干擾SpAST-AR基因后檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)譜。主要結(jié)果如下:1)SpAST-A的神經(jīng)內(nèi)分泌研究:克隆得到擬穴青蟹SpAST-A的基因片段676 bp,編碼225個(gè)氨基酸。根據(jù)AST-A的保守結(jié)構(gòu),從編碼得到的氨基酸序列可以找到10個(gè)SpAST-A小肽。實(shí)時(shí)定量PCR表明SpAST-A在檢測(cè)的卵巢、腦神經(jīng)節(jié)等6個(gè)組織中均有表達(dá),在腦神經(jīng)節(jié)中表達(dá)量最高。SpAST-A在不同發(fā)育階段的腦神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)情況:在卵黃發(fā)生前期表達(dá)量最高,在卵黃發(fā)生早期的表達(dá)量最低,在卵黃發(fā)生后期的表達(dá)量相對(duì)較高。原位雜交結(jié)果顯示,SpAST-A在腦神經(jīng)節(jié)中定位在第10和第11細(xì)胞群。上述結(jié)果表明擬穴青蟹腦神經(jīng)節(jié)是SpAST-A合成的重要場(chǎng)所。2)SpAST-A的生殖自分泌研究:克隆得到擬穴青蟹SpAST-AR的基因片段704 bp,編碼234個(gè)氨基酸。氨基酸序列分析結(jié)果顯示,具有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),同源性分析表明該蛋白應(yīng)該屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族。SpAST-A和SpAST-AR在不同發(fā)育期卵巢中的表達(dá)趨勢(shì)相似,在卵黃發(fā)生前期的表達(dá)量較高,在卵黃發(fā)生早期的表達(dá)量最低,卵黃發(fā)生后期表達(dá)量最高。原位雜交結(jié)果顯示,SpAST-A和SpAST-AR都定位在卵母細(xì)胞中,由此可以推測(cè)SpAST-A對(duì)擬穴青蟹卵巢發(fā)育的調(diào)控作用可能屬于自分泌方式。AST-A小肽體外添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AST-A1-4和AST-A1-5兩條小肽在低濃度(10-7M和10-9M)下對(duì)卵巢組織Cyclin B和VgR基因的表達(dá)都有抑制作用,并且10-9M濃度下的抑制作用最明顯;AST-A1-4和AST-A1-5兩條小肽都使SpAST-AR基因的相對(duì)表達(dá)量升高了。我們推測(cè)。SpAST-A小肽與受體結(jié)合后能夠抑制卵巢發(fā)育和卵黃發(fā)生。利用RNAi技術(shù)體外干擾SpAST-AR基因后再添加SpAST-A小肽,結(jié)果顯示SpAST-AR基因下調(diào)可以解除對(duì)CyclinB和VgR基因的抑制作用,該結(jié)果再次驗(yàn)證了SpAST-A對(duì)卵巢發(fā)育和卵黃發(fā)生可能存在抑制作用。綜上所述,擬穴青蟹,SpAST-A可能以神經(jīng)分泌和自分泌兩種方式抑制卵巢發(fā)育,該結(jié)果可以為甲殼動(dòng)物繁殖技術(shù)研發(fā)提供科學(xué)依據(jù),具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

圖２－１擬穴青蟹總ＲＮＡ電泳圖逡逑ＣＧ：腦神經(jīng)節(jié)：Ｏｖ：卵巢；Ｍ：邋Ｍａｋｅｒ

逑ＣＧ邋Ｏｖ邋Ｍ逡逑畫(huà)逡逑圖２－１擬穴青蟹總ＲＮＡ電泳圖逡逑ＣＧ：腦神經(jīng)節(jié)：Ｏｖ：卵巢；Ｍ：邋Ｍａｋｅｒ。逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｆｒｏｍ邋Ｓ．邋ｐａｒａｍａｍｏｓａｉｎ逡逑ＣＧ，邋ｃｅｒｅｂｒａｌ邋ｇａｎｇｌｉｏｎ；邋Ｏｖ，邋ｏｖａｒｙ；邋Ｍ，，邋ｍａｒｋｅｒ．逡逑２．３．２邋５＞ＡＳＴ－Ａ基因的鑒定逡逑Ａ．序列分析逡逑克隆得到６７６邋ｂｐ的片段，都處在ＯＲＦ中，編碼了邋２２５個(gè)氨基酸，序列如逡逑圖２－２。根據(jù)ＡＳＴ－Ａ的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及酶切位點(diǎn)（ＫＲ或ＫＫ）邋［４］
【學(xué)位授予單位】：廈門(mén)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 卜憲飛;李真真;喬慧;傅洪拓;吳滟;龔永生;蔣速飛;熊貽偉;;青蝦咽側(cè)體抑制激素基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆及表達(dá)分析[J];水生生物學(xué)報(bào);2013年01期

2 李娟;周嬌;駱有慶;翁強(qiáng);;保幼激素及其生理學(xué)作用的研究進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新;2012年03期

3 劉艷;勝振濤;蔣容靜;黃原;李勝;;保幼激素合成的研究進(jìn)展[J];昆蟲(chóng)學(xué)報(bào);2007年12期

4 葉海輝,李少菁,黃輝洋,王桂忠;鋸緣青蟹大顎器的顯微和超微結(jié)構(gòu)[J];海洋學(xué)報(bào)(中文版);2005年01期

5 黃輝洋,葉海輝,李少菁,王桂忠;鋸緣青蟹大顎器對(duì)卵巢發(fā)育的調(diào)節(jié)作用:離體實(shí)驗(yàn)[J];臺(tái)灣海峽;2003年03期

6 黃輝洋,李少菁,王桂忠,葉海輝;鋸緣青蟹腦的神經(jīng)分泌細(xì)胞[J];廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2001年03期

7 李勝,趙維信;甲殼動(dòng)物的大顎器和甲基法尼酯[J];上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年03期

8 趙維信,李勝;克氏原螯蝦大顎器對(duì)卵巢發(fā)育的影響[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);1999年03期

9 李勝,趙維信;克氏原螫蝦大顎器在卵巢發(fā)育周期中的組織結(jié)構(gòu)變化[J];上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào);1999年01期

本文編號(hào)：2622234