【摘要】：海灣扇貝源起于美國(guó)東海岸沿線,在二十世紀(jì)八十年代到九十年代,其南北方亞種被引進(jìn)我國(guó),一經(jīng)推廣,迅速成為我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖貝類,成功掀起了一次海水養(yǎng)殖浪潮。為了更進(jìn)一步提高提養(yǎng)殖產(chǎn)量,提升產(chǎn)品質(zhì)量,中國(guó)育種學(xué)家們采用“殼色——生長(zhǎng)性狀協(xié)同選擇”的創(chuàng)新育種方法,成功培育出新品種“中科紅”(登錄號(hào):GS-01-004-2006),并于2007年通過(guò)了全國(guó)水產(chǎn)原種和良種審定委員會(huì)的新品種審定(張國(guó)范和鄭懷平,2009)。該新品種不僅存活率提高,生長(zhǎng)速度加快,出柱率增加,且擁有醒目的殼色標(biāo)記,左右殼均為純正的橙色。為了揭示其橙色遺傳機(jī)制,為海灣扇貝的育種工作提供理論指導(dǎo),同時(shí)推進(jìn)海洋貝類殼色研究,在本研究中,采用橙色殼海灣扇貝三個(gè)自交家系(來(lái)自“中科紅”)和白殼色三個(gè)自交家系,利用簡(jiǎn)化基因組技術(shù)(2b-RAD)開發(fā)SNP分子標(biāo)簽;另外,使用“中科紅”一個(gè)自交家系,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析成色前后兩個(gè)階段的樣品差異表達(dá)情況,篩查參與海灣扇貝貝殼成色(橙色)過(guò)程候選基因。主要結(jié)論如下:1.海灣扇貝簡(jiǎn)化基因組測(cè)序分析開發(fā)SNP分子標(biāo)記樣品來(lái)自于橙色殼(“中科紅”)三個(gè)自交家系子二代和白色殼三個(gè)自交家系子二代,每個(gè)家系10個(gè)個(gè)體,構(gòu)建文庫(kù)60個(gè),使用Illumina Hiseq2500平臺(tái)測(cè)序,每個(gè)文庫(kù)獲得平均unique標(biāo)簽數(shù)目101,413,個(gè)體平均測(cè)序深度為52X。個(gè)體的測(cè)序深度能夠達(dá)到準(zhǔn)確分型的標(biāo)準(zhǔn),SNP標(biāo)記分型分析得到位點(diǎn)數(shù)44,286,通過(guò)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)14個(gè)SNP位點(diǎn)與海灣扇貝橙色殼緊密關(guān)聯(lián)。最后,在養(yǎng)殖大群中隨機(jī)挑取橙色殼和白色殼海灣扇貝各50個(gè)個(gè)體,使用SNapShot技術(shù)進(jìn)行后期驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)有5個(gè)位點(diǎn)在80%以上個(gè)體中,其驗(yàn)證結(jié)果同實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,它們是ref-2988-22、ref-125669-21、ref-40155-24、ref-40155-26和ref-82377-26。據(jù)此認(rèn)為以上5個(gè)SNP位點(diǎn)與海灣扇貝殼色(橙色和白色)這一表型緊密關(guān)聯(lián)。2.海灣扇貝轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析篩查成色相關(guān)候選基因以一個(gè)自交了11代的“中科紅”家系作為實(shí)驗(yàn)材料,在其貝殼成色前后兩階段分別取三個(gè)重復(fù)樣,構(gòu)建了六個(gè)(2×3重復(fù))文庫(kù),利用Illumina HiSeq2500平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序,得到了289,839,646條reads和70,929個(gè)轉(zhuǎn)錄本。在SWISSPROT,NR和KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì),最終成功注釋到30,896個(gè)基因。KEGG和GO注釋,富集到了許多與生物礦化和成色相關(guān)的基因。在差異表達(dá)分析中,我們發(fā)現(xiàn)了黑色素和微量金屬元素等相關(guān)基因在海灣扇貝貝殼成色后顯著上調(diào)表達(dá)。利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)對(duì)海灣扇貝橙色殼和白色殼棱柱層微量金屬(Cu,Fe,Mn,Zn)含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)兩種殼色的貝殼之間沒有顯著差異,據(jù)此猜測(cè)卟啉代謝等相關(guān)基因沒有參與貝殼的成色過(guò)程,而黑色素的作用需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以闡釋。
【圖文】：

DNA 分子標(biāo)記和 SNP 分型方法簡(jiǎn)介.1 DNA 分子標(biāo)記（1）RFLPDNA 分子標(biāo)記發(fā)起于 20 世紀(jì) 80 年代，是一種重要的生物學(xué)標(biāo)記手段環(huán)境影響、多態(tài)性高、重復(fù)性好、結(jié)果可靠著稱，在人類疾病、物種育種研究等方面得到了廣泛的運(yùn)用。最早的分子標(biāo)記是限制性片段長(zhǎng)度Restriction fragment length polymorphism, RFLP），1980 年由 Botstein 提用此標(biāo)記在人中進(jìn)行連鎖作圖（Botstein et al., 1980）。其原理是，限制會(huì)識(shí)別特定的酶切位點(diǎn)，而在同種不同個(gè)體的基因組 DNA 會(huì)有所差異可能來(lái)自于 DNA 的點(diǎn)突變、小片段插入和缺失、倒位等情況，導(dǎo)致長(zhǎng)度不一，具有出多態(tài)性（圖 1-1 所示）。

圖 1-2 RAPD 基本原理Fig. 1-2 The theory of RAPDHuff DR 采用 RAPD 法對(duì)德克薩斯墨西哥海灣的野牛草和墨西哥境內(nèi)的野牛草的遺傳多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩地的野牛草（Boutelouadactyloides）因?yàn)檫m應(yīng)著不同的生態(tài)環(huán)境，遺傳差異較大，相比于野生群體，近交導(dǎo)致了遺傳多樣性的降低（Huffetal.,1993）。Akopyanz 采用 RAPD 對(duì) 64 份來(lái)自同一家醫(yī)院不同病人身上的油門螺旋桿菌（Helicobacterpylori）研究中，，發(fā)現(xiàn) GC 含量大于等于 60%的 10 堿基長(zhǎng)度的隨機(jī)引物較 GC 含量為 50%的引物擴(kuò)增效果好，其主要的產(chǎn)物有 15 條不同的 DNA 片段，其中有一對(duì)引物顯示，60 份樣品之間具有顯著的遺傳差異，作者推論（a）在自然界中，該細(xì)菌具有廣泛的遺傳多樣性；（b）個(gè)體對(duì)不同遺傳背景的油門螺旋桿菌具有選擇性；（c）該細(xì)菌在不同個(gè)體體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間的攜帶過(guò)程中，其遺傳背景出現(xiàn)了分化（Akopyanzetal.,1992）。王玉娟等人對(duì) RAPD
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2619473