【摘要】：莫荷羅非魚“廣福1號”可在鹽度為0~30‰的水體中生長,在耐鹽堿方面與親本相比具有明顯的雜種優(yōu)勢。本研究從DNA甲基化角度分析了雜交種“廣福1號”與親本基因組DNA的甲基化差異以及這種差異是否與雜種優(yōu)勢有關。通過甲基化差異片段篩選獲得prkaca基因,并對該基因進行序列結構分析以及在鹽堿脅迫下的組織表達分析,初步了解prkaca基因的功能。利用BSP技術進一步分析prkaca基因啟動子甲基化水平與該基因表達變化之間的關系。研究結果在雜交新品種莫荷羅非魚“廣福1號”表觀分子標記篩選及羅非魚耐鹽堿脅迫相關基因的功能研究方面具有重要的意義。1.莫荷羅非魚“廣福1號”與親本基因組DNA的甲基化差異分析以橙色莫桑比克羅非魚、荷那龍羅非魚及其雜交種莫荷羅非魚“廣福1號”為研究對象,運用甲基化敏感擴增多態(tài)技術(Methylation Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)分析親、子代羅非魚在皮膚、肌肉和鰓等11種組織的DNA甲基化水平差異及甲基化模式的變化。實驗結果顯示:莫荷羅非魚“廣福1號”與親本在不同組織間的甲基化水平存在組織特異性,相同組織在不同親、子代羅非魚間的甲基化程度亦存在差異;橙色莫桑比克羅非魚、荷那龍羅非魚以及莫荷羅非魚“廣福1號”各組織平均總甲基化水平分別為38.03%、32.21%和29.77%,“廣福1號”的總甲基化水平低于雙親;莫荷羅非魚“廣福1號”有75.08%胞嘧啶位點的甲基化模式與親本相同,24.92%胞嘧啶位點發(fā)生去甲基化和超甲基化,且發(fā)生去甲基化的位點數(shù)(E類型,15.73%)多于超甲基化位點數(shù)(D類型,9.19%)。此外,通過甲基化差異片段分析篩選獲得prkaca基因,并把prkaca基因作為下一步研究的目的基因。2.莫荷羅非魚“廣福1號”prkaca基因的克隆和組織表達分析蛋白激酶A(PKA)是由調(diào)節(jié)(R)亞基二聚體和兩個催化(C)亞基二聚體組成的四聚體。當?shù)诙攀筩AMP與R亞基結合時,會導致PKA全酶的構象發(fā)生變化以釋放C亞基而發(fā)揮生物學作用。prkaca基因是蛋白激酶A(PKA)家族的一員,編碼PKA的催化亞基。以尼羅羅非魚的prkaca基因序列為模板設計引物,獲得母本橙色莫桑比克羅非魚、父本荷那龍羅非魚和莫荷羅非魚“廣福1號”prkaca基因完整的cDNA序列。cDNA全長4975bp,包含1056bp開放閱讀框,編碼351個氨基酸。氨基酸結構域預測分析結果顯示:羅非魚的Prkaca氨基酸序列存在一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域(S_TKc)和一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶延伸結構域(S_TK_X)。氨基酸序列同源性比較表明,親、子代三種羅非魚的Prkaca氨基酸序列與尼羅羅非魚、斑馬擬麗魚和伯氏樸麗魚氨基酸序列完全一致(100%),與其他魚類具有93.7%-99.4%的同源性。實時熒光定量PCR結果顯示:prkaca基因在母本橙色莫桑比克羅非魚和父本荷那龍羅非魚10個組織或器官的表達水平存在明顯差異。prkaca基因在腦組織中表達量極顯著高于其他各組織或器官(P0.01)。母本橙色莫桑比克羅非魚、父本荷那龍羅非魚、莫荷羅非魚“廣福1號”和尼羅羅非魚經(jīng)過鹽堿脅迫(鹽度10,堿度3g//L,S10A3)后,肌肉、鰓、腎臟和腦組織在不同時間點(0 h、24 h、48 h、72 h和96 h)的prkaca基因的表達變化均呈現(xiàn)先顯著上升(P0.05)、后顯著下降并恢復至處理前水平的一種變化趨勢。莫荷羅非魚“廣福1號”的prkaca基因表達量在24 h顯著增加,而其親本基因表達量則在72 h顯著增加。由此可見prkaca基因可能參與羅非魚的滲透壓調(diào)節(jié),且莫荷羅非魚“廣福1號”在應對水環(huán)境鹽堿度變化時具有維持體內(nèi)滲透壓平衡的快速應答機制。3.莫荷羅非魚“廣福1號”及親本prkaca基因DNA甲基化水平分析首先克隆得到prkaca基因組序列,通過PCR獲得prkaca基因組DNA全長21207bp,包含11個外顯子和10個內(nèi)含子。通過MethPrimer和JASPAR在線軟件分析可能存在的CpG島,選擇含有4個轉錄因子結合位點的長度為416bp(-544,-129)的啟動子序列作為甲基化分析目的片段。一方面,運用重亞硫酸鹽(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)技術檢測莫荷羅非魚“廣福1號”在鹽堿脅迫各時間點下肌肉和腎臟組織prkaca基因啟動子區(qū)域的甲基化水平,并分析其甲基化水平的變化與基因表達之間的關系。以莫荷羅非魚“廣福1號”鹽堿脅迫下(S10A3)0 h時的甲基化水平為參照,肌肉組織prkaca基因啟動子在24 h和72 h的甲基化水平顯著下降(P0.05)和顯著上調(diào)(P0.05),腎臟組織prkaca基因啟動子在48 h的甲基化程度顯著高于0 h(P0.05)。結合莫荷羅非魚“廣福1號”鹽堿脅迫下prkaca基因表達變化發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平與表達水平變化基本呈現(xiàn)負相關。另一方面,分析比較莫荷羅非魚“廣福1號”與親本prkaca基因啟動子區(qū)域的甲基化水平差異。子代“廣福1號”與親本在肌肉組織中prkaca基因啟動子甲基化水平之間無顯著差異(P0.05);腎臟組織中,莫荷羅非魚“廣福1號”prkaca基因的甲基化水平顯著低于雙親(P0.05),有可能是雜交種基因組DNA甲基化水平呈現(xiàn)低甲基化的表現(xiàn)形式之一。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2614479