發(fā)布時(shí)間：2020-04-05 03:37

【摘要】：莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”可在鹽度為0~30‰的水體中生長(zhǎng),在耐鹽堿方面與親本相比具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)。本研究從DNA甲基化角度分析了雜交種“廣福1號(hào)”與親本基因組DNA的甲基化差異以及這種差異是否與雜種優(yōu)勢(shì)有關(guān)。通過甲基化差異片段篩選獲得prkaca基因,并對(duì)該基因進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析以及在鹽堿脅迫下的組織表達(dá)分析,初步了解prkaca基因的功能。利用BSP技術(shù)進(jìn)一步分析prkaca基因啟動(dòng)子甲基化水平與該基因表達(dá)變化之間的關(guān)系。研究結(jié)果在雜交新品種莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”表觀分子標(biāo)記篩選及羅非魚耐鹽堿脅迫相關(guān)基因的功能研究方面具有重要的意義。1.莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”與親本基因組DNA的甲基化差異分析以橙色莫桑比克羅非魚、荷那龍羅非魚及其雜交種莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”為研究對(duì)象,運(yùn)用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)技術(shù)(Methylation Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)分析親、子代羅非魚在皮膚、肌肉和鰓等11種組織的DNA甲基化水平差異及甲基化模式的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”與親本在不同組織間的甲基化水平存在組織特異性,相同組織在不同親、子代羅非魚間的甲基化程度亦存在差異;橙色莫桑比克羅非魚、荷那龍羅非魚以及莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”各組織平均總甲基化水平分別為38.03%、32.21%和29.77%,“廣福1號(hào)”的總甲基化水平低于雙親;莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”有75.08%胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化模式與親本相同,24.92%胞嘧啶位點(diǎn)發(fā)生去甲基化和超甲基化,且發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)數(shù)(E類型,15.73%)多于超甲基化位點(diǎn)數(shù)(D類型,9.19%)。此外,通過甲基化差異片段分析篩選獲得prkaca基因,并把prkaca基因作為下一步研究的目的基因。2.莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”prkaca基因的克隆和組織表達(dá)分析蛋白激酶A(PKA)是由調(diào)節(jié)(R)亞基二聚體和兩個(gè)催化(C)亞基二聚體組成的四聚體。當(dāng)?shù)诙攀筩AMP與R亞基結(jié)合時(shí),會(huì)導(dǎo)致PKA全酶的構(gòu)象發(fā)生變化以釋放C亞基而發(fā)揮生物學(xué)作用。prkaca基因是蛋白激酶A(PKA)家族的一員,編碼PKA的催化亞基。以尼羅羅非魚的prkaca基因序列為模板設(shè)計(jì)引物,獲得母本橙色莫桑比克羅非魚、父本荷那龍羅非魚和莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”prkaca基因完整的cDNA序列。cDNA全長(zhǎng)4975bp,包含1056bp開放閱讀框,編碼351個(gè)氨基酸。氨基酸結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示:羅非魚的Prkaca氨基酸序列存在一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域(S_TKc)和一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶延伸結(jié)構(gòu)域(S_TK_X)。氨基酸序列同源性比較表明,親、子代三種羅非魚的Prkaca氨基酸序列與尼羅羅非魚、斑馬擬麗魚和伯氏樸麗魚氨基酸序列完全一致(100%),與其他魚類具有93.7%-99.4%的同源性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:prkaca基因在母本橙色莫桑比克羅非魚和父本荷那龍羅非魚10個(gè)組織或器官的表達(dá)水平存在明顯差異。prkaca基因在腦組織中表達(dá)量極顯著高于其他各組織或器官(P0.01)。母本橙色莫桑比克羅非魚、父本荷那龍羅非魚、莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”和尼羅羅非魚經(jīng)過鹽堿脅迫(鹽度10,堿度3g//L,S10A3)后,肌肉、鰓、腎臟和腦組織在不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、24 h、48 h、72 h和96 h)的prkaca基因的表達(dá)變化均呈現(xiàn)先顯著上升(P0.05)、后顯著下降并恢復(fù)至處理前水平的一種變化趨勢(shì)。莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”的prkaca基因表達(dá)量在24 h顯著增加,而其親本基因表達(dá)量則在72 h顯著增加。由此可見prkaca基因可能參與羅非魚的滲透壓調(diào)節(jié),且莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”在應(yīng)對(duì)水環(huán)境鹽堿度變化時(shí)具有維持體內(nèi)滲透壓平衡的快速應(yīng)答機(jī)制。3.莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”及親本prkaca基因DNA甲基化水平分析首先克隆得到prkaca基因組序列,通過PCR獲得prkaca基因組DNA全長(zhǎng)21207bp,包含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。通過MethPrimer和JASPAR在線軟件分析可能存在的CpG島,選擇含有4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的長(zhǎng)度為416bp(-544,-129)的啟動(dòng)子序列作為甲基化分析目的片段。一方面,運(yùn)用重亞硫酸鹽(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)技術(shù)檢測(cè)莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”在鹽堿脅迫各時(shí)間點(diǎn)下肌肉和腎臟組織prkaca基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平,并分析其甲基化水平的變化與基因表達(dá)之間的關(guān)系。以莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”鹽堿脅迫下(S10A3)0 h時(shí)的甲基化水平為參照,肌肉組織prkaca基因啟動(dòng)子在24 h和72 h的甲基化水平顯著下降(P0.05)和顯著上調(diào)(P0.05),腎臟組織prkaca基因啟動(dòng)子在48 h的甲基化程度顯著高于0 h(P0.05)。結(jié)合莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”鹽堿脅迫下prkaca基因表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平與表達(dá)水平變化基本呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。另一方面,分析比較莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”與親本prkaca基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平差異。子代“廣福1號(hào)”與親本在肌肉組織中prkaca基因啟動(dòng)子甲基化水平之間無顯著差異(P0.05);腎臟組織中,莫荷羅非魚“廣福1號(hào)”prkaca基因的甲基化水平顯著低于雙親(P0.05),有可能是雜交種基因組DNA甲基化水平呈現(xiàn)低甲基化的表現(xiàn)形式之一。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2614479