細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)系統(tǒng)是作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的遺傳基礎(chǔ)。目前,水稻(Oryza sativa L.)“三系”雜交稻的生產(chǎn)應(yīng)用主要依賴于野敗型(wild-abortive)細(xì)胞質(zhì)雄性不育及恢復(fù)系統(tǒng)(CMS-WA/Rf)。研究表明,恢復(fù)基因Rf4編碼一個(gè)P類PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白,通過(guò)降解不育基因WA352 mRNA轉(zhuǎn)錄本而恢復(fù)育性,但RF4蛋白是如何結(jié)合WA352 mRNA并介導(dǎo)其降解的分子機(jī)理仍需進(jìn)一步探究。本研究在前期克隆恢復(fù)基因Rf4的基礎(chǔ)上,通過(guò)體外下拉實(shí)驗(yàn)(Pull-down assay)和質(zhì)譜分析篩選得到RF4互作蛋白OsMUS81,并對(duì)其進(jìn)行與RF4互作的驗(yàn)證,同時(shí)通過(guò)基因編輯對(duì)OsMUS81基因進(jìn)行功能研究,獲得如下結(jié)果:1)以RF4為誘餌通過(guò)體外下拉實(shí)驗(yàn),獲得與之互作的水稻蛋白復(fù)合體,并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,通過(guò)分析得到一個(gè)含有ERCC4結(jié)構(gòu)域,具有核酸內(nèi)切酶活性的互作蛋白OsMUS81。2)進(jìn)一步利用一對(duì)一的酵母雙雜實(shí)驗(yàn)、Pull-down實(shí)驗(yàn)以及BiFC實(shí)驗(yàn)技術(shù)證實(shí)了RF4與Os...

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 前言
    1.1 研究背景
        1.1.1 高等植物的細(xì)胞質(zhì)雄性不育
        1.1.2 水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育的研究進(jìn)展
        1.1.3 MUS81基因的研究進(jìn)展
    1.2 本研究的目的和意義
    1.3 本研究的技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 水稻材料
        2.1.2 菌種與載體
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
    2.2 主要試劑配方
        2.2.1 常用試劑配方
        2.2.2 酵母雙雜(Y2H)相關(guān)試劑
        2.2.3 原核表達(dá)及純化相關(guān)試劑
        2.2.4 蛋白SDS-PAGE相關(guān)試劑
        2.2.5 Westernblot相關(guān)試劑
        2.2.6 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化相關(guān)試劑
        2.2.7 水稻組織培養(yǎng)相關(guān)試劑
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法
            2.3.1.1 水稻DNA微量抽提法
            2.3.1.2 花粉育性觀察
            2.3.1.3 常規(guī)載體構(gòu)建
        2.3.2 蛋白Pull-down實(shí)驗(yàn)
            2.3.2.1 植物蛋白的抽提
            2.3.2.2 融合蛋白的原核誘導(dǎo)表達(dá)
            2.3.2.3 融合蛋白的體外結(jié)合
            2.3.2.4 融合蛋白與植物蛋白的半體外結(jié)合
            2.3.2.5 蛋白的Westernblot分析
        2.3.3 Y2H互作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
        2.3.4 水稻樣品RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及定量PCR實(shí)驗(yàn)
            2.3.4.1 水稻樣品RNA的抽提
            2.3.4.2 RNA反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)
            2.3.4.3 定量PCR實(shí)驗(yàn)
        2.3.5 互作蛋白的亞細(xì)胞定位及熒光雙分子互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗(yàn)
            2.3.5.1 瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.3.5.2 水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
        2.3.6 CRISPR/Cas9雙靶點(diǎn)敲除載體構(gòu)建
        2.3.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
3 結(jié)果與分析
    3.1 RF4互作因子的篩選
        3.1.1 利用體外Pull-down實(shí)驗(yàn)篩選RF4的互作蛋白
        3.1.2 RF4互作蛋白的質(zhì)譜分析
    3.2 RF4與OsMUS81的互作驗(yàn)證
        3.2.1 利用Y2H實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RF4與OsMUS81的互作
        3.2.2 利用Pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RF4與OsMUS81的互作
        3.2.3 利用BiFC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RF4與OsMUS81的互作
    3.3 OsMUS81的功能研究
        3.3.1 OsMUS81的亞細(xì)胞定位
        3.3.2 OsMUS81的基因敲除及遺傳分析
            3.3.2.1 OsMUS81的基因敲除
            3.3.2.2 T0敲除突變體突變位點(diǎn)的分子檢測(cè)
            3.3.2.3 敲除突變體的表型觀察
            3.3.2.4 敲除突變體中WA352的表達(dá)分析
4 討論與結(jié)論
    4.1 討論
    4.2 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：3910714