大豆是重要的糧油兼用作物,世界各地均有種植。大豆種子中含有豐富的脂肪、植物蛋白以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但是大豆的生長(zhǎng)環(huán)境使其經(jīng)常面臨病原體、害蟲(chóng)等生物脅迫和高溫、干旱等非生物脅迫的侵害,生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重影響,從而導(dǎo)致大豆產(chǎn)量下降和品質(zhì)惡化,因此需要有效且經(jīng)濟(jì)的方法來(lái)改良大豆品種。大豆的基因組比較大,調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制復(fù)雜,隨著越來(lái)越多的抗病基因被發(fā)現(xiàn),對(duì)啟動(dòng)子等基因表達(dá)調(diào)控元件的研究也刻不容緩。但是目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)常用的啟動(dòng)子大多為組成型表達(dá)的啟動(dòng)子,這可能在轉(zhuǎn)基因植株中引起額外的代謝負(fù)擔(dān)或毒性效應(yīng)。因此,為了對(duì)基因的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行更深入的研究,就需要能夠指導(dǎo)目的基因在特定的組織和器官中表達(dá)的組織特異型啟動(dòng)子。本研究通過(guò)已發(fā)表的大豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選組織特異表達(dá)的基因,并在大豆全基因組信息數(shù)據(jù)庫(kù)中查找基因上游的啟動(dòng)子序列,從大豆品種Williams 82中克隆啟動(dòng)子序列并構(gòu)建了啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染轉(zhuǎn)化擬南芥得到陽(yáng)性植株,并用GUS染色及RT-PCR驗(yàn)證啟動(dòng)子的表達(dá)模式。同時(shí)用轉(zhuǎn)入了組織特異啟動(dòng)子GUS表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆,獲得毛狀根,用GUS染色驗(yàn)證啟動(dòng)子在大豆毛...

【文章頁(yè)數(shù)】：72 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 引言
    1.1 研究背景
    1.2 植物啟動(dòng)子概述
        1.2.1 組成型啟動(dòng)子
        1.2.2 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子
        1.2.3 組織特異型啟動(dòng)子
    1.3 組織特異型啟動(dòng)子研究進(jìn)展
        1.3.1 植物啟動(dòng)子特異表達(dá)相關(guān)元件
        1.3.2 根特異表達(dá)啟動(dòng)子
        1.3.3 葉特異表達(dá)啟動(dòng)子
        1.3.4 花特異表達(dá)啟動(dòng)子
        1.3.5 種子特異表達(dá)啟動(dòng)子
    1.4 啟動(dòng)子研究的方法
        1.4.1 啟動(dòng)子的分離克隆方法
        1.4.2 啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析
        1.4.3 啟動(dòng)子表達(dá)模式的驗(yàn)證
    1.5 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化
    1.6 研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 載體和菌株
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及培養(yǎng)基
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 大豆基因組DNA的提取
        2.2.2 大豆組織特異表達(dá)基因的篩選
        2.2.3 RT-PCR驗(yàn)證大豆組織特異表達(dá)基因的表達(dá)模式
        2.2.4 組織特異啟動(dòng)子的克隆
        2.2.5 啟動(dòng)子GUS表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.6 農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥
        2.2.7 擬南芥培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因植株篩選
        2.2.8 陽(yáng)性植株的組織化學(xué)分析
        2.2.9 GUS表達(dá)量RT-PCR檢測(cè)
        2.2.10 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.11 大豆毛狀根的組織化學(xué)染色
3 結(jié)果與分析
    3.1 大豆組織特異表達(dá)基因的篩選
    3.2 RT-PCR驗(yàn)證大豆組織特異表達(dá)基因的表達(dá)模式
    3.3 組織特異啟動(dòng)子的克隆與載體構(gòu)建
        3.3.1 組織特異啟動(dòng)子的克隆
        3.3.2 啟動(dòng)子GUS表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的篩選
        3.4.1 Basta篩選抗性植株
        3.4.2 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株Bar試紙條檢驗(yàn)
        3.4.3 轉(zhuǎn)基因T1代植株目的基因的檢測(cè)
        3.4.4 已獲得的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株
    3.5 擬南芥陽(yáng)性植株組織化學(xué)分析(GUS染色)
        3.5.1 葉特異啟動(dòng)子GUS染色結(jié)果
        3.5.2 根特異啟動(dòng)子GUS染色結(jié)果
        3.5.3 組成型啟動(dòng)子及野生型擬南芥GUS染色結(jié)果
    3.6 擬南芥陽(yáng)性植株GUS表達(dá)情況檢測(cè)
        3.6.1 擬南芥各組織RNA提取結(jié)果
        3.6.2 葉特異啟動(dòng)子GUS表達(dá)情況檢測(cè)
        3.6.3 根特異啟動(dòng)子GUS表達(dá)情況檢測(cè)
        3.6.4 組成型啟動(dòng)子GUS表達(dá)情況檢測(cè)
    3.7 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染大豆及GUS染色鑒定
        3.7.1 大豆毛狀根的獲得
        3.7.2 發(fā)根誘導(dǎo)率及發(fā)根數(shù)
        3.7.3 組織特異啟動(dòng)子GUS染色結(jié)果
        3.7.4 GUS基因轉(zhuǎn)化效率
    3.8 組織特異啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3840634