【目的】氨酰-tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetases, aa RSs）與遺傳信息傳遞密切相關(guān),已發(fā)現(xiàn)植物中aaRSs家族蛋白在維持翻譯功能之余,還參與配子發(fā)生與胚發(fā)育、質(zhì)體的早期發(fā)育以及免疫信號的感知與病害防御等生物學(xué)過程。本研究利用水稻胚乳發(fā)育缺陷突變體,分析水稻色氨酰-tRNA合成酶（WRS1）在胚乳發(fā)育中的作用,證明WRS1基因編碼一個影響水稻胚乳發(fā)育的關(guān)鍵因子。【方法】本研究通過甲烷磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate, EMS）誘變秈稻（Oryza sativa subsp. indica）品種N22,篩選到一個穩(wěn)定遺傳的水稻粉質(zhì)胚乳突變體（wrs1）,圖位克隆獲得目標(biāo)基因。對wrs1成熟種子進行形態(tài)學(xué)觀察以及淀粉相關(guān)理化性質(zhì)測定,利用細胞學(xué)切片分析wrs1發(fā)育中胚乳的結(jié)構(gòu),利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和GUS活性染色分析基因表達模式,通過q RT-PCR比較野生型與突變體花后12 d胚乳中淀粉合成相關(guān)基因表達情況,免疫印跡檢測野生型與突變體成熟種子中淀粉合成... 

【文章來源】：中國水稻科學(xué). 2020,34(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：14 頁

【部分圖文】：

野生型與wrs1突變體表型分析

與野生型相比，wrs1突變體籽�？偟矸酆肯陆盗�7.18%，直鏈淀粉含量無差異（圖2-A～B）。基于上述淀粉顆粒形態(tài)及總淀粉含量的變化，對突變體中淀粉理化特性進一步探究。RVA譜分析野生型和突變體淀粉糊化特性的變化，結(jié)果表明wrs1突變體淀粉的黏度分布類似于野生型但水平較低，其峰值黏度和最終黏度分別為野生型的81.84%和87.52%（圖2-C，表2）。尿素濃度梯度溶解實驗顯示，突變體米粉更難溶于尿素溶液中，在4 mol/L時突變體和野生型溶解體積出現(xiàn)差異，6 mol/L時差異達到顯著（圖2-D～E）。綜上所述，wrs1突變體中胚乳的主要填充物淀粉的含量及理化特性發(fā)生相應(yīng)改變。2.3 wrs1造粉體發(fā)育異常

由于wrs1突變體純合致死，將wrs1雜合植株與粳稻滇粳優(yōu)1號配組，從F2群體中挑選46個具有粉質(zhì)胚乳表型的隱性極端個體，利用133個覆蓋水稻12條染色體的InDel和SSR多態(tài)性標(biāo)記進行連鎖分析。初步將基因定位在第12染色體長臂的3.7 Mb區(qū)間內(nèi)，進一步篩選了974個極端個體并開發(fā)標(biāo)記將基因限定在183 kb區(qū)間內(nèi)（圖4-A）。利用NCBI數(shù)據(jù)庫預(yù)測，該區(qū)間內(nèi)有16個開放讀碼框（open reading frames,ORFs）。進一步測序發(fā)現(xiàn)wrs1突變體在基因Os12g0540900的第6外顯子上存在一個SNP（由G變成T），導(dǎo)致甲硫氨酸（Met）被異亮氨酸（Ile）替換（圖4-B）。Os12g0540900基因編碼區(qū)序列全長1227 bp，編碼一個色氨酰-tRNA合成酶（WRS1）。為驗證Os12g0540900是目的基因，構(gòu)建了由花椰菜花葉病毒的35S啟動子驅(qū)動WRS1編碼區(qū)的pCAMBIA1305.1-WRS1-GFP載體，轉(zhuǎn)化wrs1突變體愈傷。提取T0代轉(zhuǎn)基因植株葉片的DNA，進行轉(zhuǎn)基因陽性PCR檢測（圖4-C），進一步測序確認轉(zhuǎn)基因陽性家系基因組序列中Os12g0540900基因型與突變體一致，且植株能正常生長、種子表型恢復(fù)透明（圖4-D）。因此，突變的Os12g0540900確實是導(dǎo)致wrs1表型的基因。


本文編號：3563775