玉米（ZeamaysL.）是重要糧食經(jīng)濟作物,生物和非生物脅迫都會導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。玉米在受到脅迫時會產(chǎn)生許多小分子次生代謝化合物,其中數(shù)量最多的是萜類,包括具有抗病活性和昆蟲拒食活性的萜類植保素zealexin和kauralexin。萜類是由萜烯合酶催化前體（FPP/GPP/GGPP）環(huán)化并被進(jìn)一步修飾形成。玉米中已經(jīng)鑒定了多個萜烯合酶,如單萜合酶ZmTPS26、倍半萜合酶ZmTPS6/11以及二萜合酶ZmKSL5等。但玉米基因組中還存在著許多未被鑒定功能的萜烯合酶。本研究是對玉米中三個未知功能的萜烯合酶ZmTPS7、ZmKSL2和ZmKSL4進(jìn)行研究。首先利用微生物代謝工程進(jìn)行重組表達(dá),通過GC-MS檢測其催化產(chǎn)物,最終確定其生化功能。并對ZmTPS7主要產(chǎn)物進(jìn)行體外抑菌試驗,探索其抑菌活性。同時分析了這三個萜烯合酶在各種脅迫和激素處理下的基因表達(dá)模式,初步確定了其生物學(xué)功能。主要結(jié)果如下:1.本研究證明玉米萜烯合酶ZmTPS7是一個τ-cadinol合酶。我們將FPP合酶與ZmTPS7在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá),并利用GC-MS檢測其催化產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZmTPS7能催化FPP... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖３ＺｍＴＰＳ７蛋白純化??注：箭頭代表目標(biāo)蛋白??

發(fā)現(xiàn)該蛋白能催化／ｒａｍ－ＦＰＰ形成Ｔ－ｃａｄｉｎｏ丨，與微生物代謝工程所得的結(jié)果一致。然??后檢測在不同ｐＨ條件下該酶的催化活性，結(jié)果顯示ＺｍＴＰＳ７在ｐＨ６－ｐＨ９時均有活性，??且在ｐＨ為８的時候活性最高（圖４?ａ），與已經(jīng)報導(dǎo)的倍半萜合酶的最適ＰＨ值相似。??之前的研究發(fā)現(xiàn)作為輔助因子的二價金屬陽離子對于酶的活性影響較大，本文選擇了??不同的二價金屬離子進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)１〇?Ｍｇ２＋是ＺｍＴＰＳ７的最適金屬輔助因??子（圖４?ｂ）。同時本研究還進(jìn)行了酶動力學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＺｍＴＰＳ７的酶動力學(xué)參??數(shù)仏為６．５±０．３ｎＭ，值為（１．３６±０．０２）?ｘ１（Ｔ３ｓ－１。與其他植物的倍半萜合酶的??酶動力學(xué)參數(shù)是相似的，更進(jìn)一步證明ＺｍＴＰＳ７是倍半萜合酶。??ａ?Ｉ?ｂ??６０?Ｔ?５０?１??３?Ｉ?３?Ｉ?＞１０ｍＭ??｜?５〇?．?｜?Ｉ?｜?４０?？?Ｂ〇－２５ｍＭ??ｌ?ｉ?Ｉ！??１?ＡＵＬ１：?ｉｉｉｌ！??５?６?７?８?９?１０?Ｍｇ?Ｍｎ?Ｚｎ?Ｃａ?Ｃｕ?ｎｏｎｅ??圖４?ＺｍＴＰＳ７的最適ｐＨ與金屬輔助因子??ａ，ｐＨ決定ＺＩｎＴＰＳ７的活性，該反應(yīng)是在１０ｍＭＭｇ２＋輔助因子存在下進(jìn)行的體外實驗。ｂ，金屬輔??助因子對ＺｍＴＰＳ７的影響，選擇１０?ｍＭ和０．２５?ｍＭ兩個濃度來進(jìn)行體外實驗。同時所有的實驗??都設(shè)置了三個重復(fù)。??Ｆｉｇ?４?ｐＨ?ｏｐｔｉｍｕｍ?ａｎｄ?ｍｅｔａｌｉｏｎ?ｃｏｆａｃｔｏｒｓ?ｏｆ?ＺｍＴＰＳ７??ａ

脅迫所誘導(dǎo)。在不做處理的條件下，不管是無菌苗還是土壤里中的玉米幼苗，加７＾５７??在地上部分的表達(dá)量均要高于地下部分的表達(dá)量，說明其本底表達(dá)量主要集中于地上??部分的葉片（圖５?ａ－ｂ）。對于生物與非生物脅迫誘導(dǎo)來說，禾谷鐮刀菌與ＭｅＪＡ均??能顯著誘導(dǎo)玉米葉片中的表達(dá)（圖９?ｃｄ）。植物激素ＡＢＡ也能極顯著誘導(dǎo)??在根中表達(dá)，尤其是在處理２４?ｈ后，它能被誘導(dǎo)增加２０倍（圖５?ｅ）。但是??在用ＡＢＡ處理地下的根后，地上部分的表達(dá)量被抑制，尤其在１２?ｈ和２４?ｈ??時被極顯著抑制（圖６）。這與地下部分的表達(dá)模式完全相反，可能是由于地上地下??存在不同的調(diào)控方式，因此要想更深入的了解必須進(jìn)行進(jìn)一步的研究。??２６??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]植物萜類生物合成與抗蟲反應(yīng)[J]. 陳曉亞,王凌健,毛穎波,楊長青.  生命科學(xué). 2015(07)
[2]植物萜類次生代謝及其調(diào)控[J]. 王凌健,方欣,楊長青,李建戌,陳曉亞.  中國科學(xué):生命科學(xué). 2013(12)
[3]倍半萜類化合物生物活性研究進(jìn)展[J]. 樸英花,樸惠順.  職業(yè)與健康. 2012(18)
[4]次生代謝產(chǎn)物與植物抗病防御反應(yīng)[J]. 郭艷玲,張鵬英,郭默然,陳靠山.  植物生理學(xué)報. 2012(05)
[5]植物萜類化合物的生物合成及應(yīng)用[J]. 占愛瑤,由香玲,詹亞光.  生物技術(shù)通訊. 2010(01)
[6]植物萜類化合物的天然合成途徑及其相關(guān)合酶[J]. 張長波,孫紅霞,鞏中軍,祝增榮.  植物生理學(xué)通訊. 2007(04)
[7]植物類萜生物合成途徑及關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展[J]. 馬靚,丁鵬,楊廣笑,何光源.  生物技術(shù)通報. 2006(S1)
[8]萜類生物合成的基因操作[J]. 黃瑛,曾慶平.  中國生物工程雜志. 2006(01)
[9]植物萜類化合物的生物合成途徑及其關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展[J]. 羅永明,劉愛華,李琴,黃璐琦.  江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2003(01)
[10]青蒿素研究進(jìn)展[J]. 李偉,石崇榮.  中國藥房. 2003(02)

博士論文
[1]棉屬（Gossypium）特殊腺體發(fā)育相關(guān)基因和棉酚合成關(guān)鍵酶基因的克隆及棉酚的分析[D]. 蔡應(yīng)繁.四川大學(xué) 2003



本文編號：3520011