細(xì)胞色素P450羥化酶基因（Cytochrome P450 hydroxylase,NtCYP71D16）催化煙草西柏三烯一醇脫氫生成西柏三烯二醇,是煙草西柏烷類腺毛分泌物生物合成的關(guān)鍵酶基因,對(duì)煙草葉面化學(xué)的形成具有重要影響。本文克隆了煙草栽培品種K326的NtCYP71D16基因,采用RT-PCR技術(shù)和Promotor-GUS infusion技術(shù),分析了該基因的組織表達(dá)特性以及對(duì)溫度和MeJA的應(yīng)答反應(yīng)模式;比較了典型烤煙品種中葉面腺毛的形態(tài)、西柏烷類化合物積累以及西柏烷代謝途徑關(guān)鍵酶基因（NtCYP71D16和NtCYC）表達(dá)的差異;在此基礎(chǔ)上,采用RNAi技術(shù),實(shí)現(xiàn)了NtCYP71D16基因在K326中的抑制表達(dá),并對(duì)RNAi轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀、葉面化學(xué)成分、抗性及烤后煙葉香氣成分進(jìn)行了比較分析。該研究結(jié)果為NtCYP71D16基因在煙草葉面化學(xué)調(diào)控及抗性及品質(zhì)改良中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1、采用同源克隆技術(shù),在烤煙K326中獲得三條NtCYP71D16（AF166332.1）基因同源序列NtCYP71D16,NtCYP71D16v2,NtCYP71D16... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【圖文】：

PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

26ORFfinder分析發(fā)現(xiàn),它們均包含起始和終止密碼子，它們均編碼499個(gè)氨基酸;序列比對(duì)結(jié)果見圖3。NtCYP71D16蛋白與NtCYP71D16v2以及NtCYP71D16v3的序列一致性均為93.9%，而NtCYP71D16v2與NtCYP71D16v3的一致性達(dá)96.1%。氨基酸序列比對(duì)見下圖。圖3氨基酸序列比對(duì)使用PROSITE(http://www.expasy.ch/prosite/)和SMART軟件對(duì)該基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)。如圖4所示，3個(gè)蛋白均包含P450蛋白家族保守的結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步表明克隆到的基因?yàn)闊煵菹倜玃450家族基因。圖4.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析4.1.2NtCYP71D16基因組織表達(dá)特異性分析為了探究不同組織該基因的相對(duì)表達(dá)量的差異，對(duì)K326的上部葉、中部葉、下部葉、根、莖、花、種子、去腺毛的葉片和腺毛做了RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果如下表（4）：每個(gè)組織做三次重復(fù)，以去腺毛葉片為對(duì)照，并作圖。表4煙草組織RT-PCR結(jié)果內(nèi)參基因Ct煙草部位CtΔCtΔΔCt相對(duì)表達(dá)量均值根-L2519.86根29.659.791.753333330.29661565929.699.840.28791433719.851.803333330.2865118419.8429.719.871.833333330.280615512莖-L2521.56莖32.9411.383.343333330.09852725432.7211.210.09520494821.513.173333330.11084892421.5533.311.753.713333330.076238665上部葉-L2521.29上部葉30.489.191.153333330.4495852680.474690745

2721.3330.359.020.983333330.5058097221.3230.459.131.093333330.468677248中部葉-L2521.44中部葉30.579.131.093333330.46867724830.569.10.47088075321.461.063333330.47852515421.4330.579.141.103333330.465439858下部葉-L2522.29下部葉30.428.130.093333330.93735449730.448.140.9816572622.30.103333330.93087971622.3130.247.93-0.10666671.076737568花-L2523.14花27.033.89-4.146666717.7121405127.053.9417.1156506423.11-4.096666717.1087999823.1227.113.99-4.046666716.52601144種子-L2520.06種子33.5313.475.433333330.02314214933.4713.40.02455073920.075.363333330.024292720.0333.3213.295.253333330.026217368去腺毛葉片-L2522.98去腺毛葉片30.687.7-0.33666671.26283545131.228.231.01428096122.990.193333330.8745826722.9831.168.180.143333330.905424761腺毛-L2522.33腺毛27.745.41-2.62666676.17597394727.815.495.95387623522.32-2.54666675.84282737822.3327.825.49-2.54666675.842827378如圖5可知，煙草K326品種中，花中NtCYP71D16基因的表達(dá)量最高，其次是腺毛中，花與腺毛中該基因的表達(dá)量呈極顯著性差異，而種子中含量最少。不同部位的葉片該基因的相對(duì)表達(dá)量也有區(qū)別，下部葉含量最高，與去腺毛葉片中該基因的表達(dá)量無極顯著性差異。圖5NtCYP71D16基因在不同組織中的表達(dá)量4.1.3NtCYP71D6基因啟動(dòng)子活性分析4.1.3.1組織特性分析以pCAMBIA1391-CYP-GUS轉(zhuǎn)基因植株為材料，分別取其根、莖、葉等部位為材料，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，在超景深顯微鏡下進(jìn)行觀察，從圖6可發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的莖、

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]煙草重要基因篇13: 煙草腺毛發(fā)生和發(fā)育相關(guān)基因[J]. 張洪映,崔紅.  中國煙草科學(xué). 2016(01)
[2]植物腺毛次生代謝產(chǎn)物生物合成的研究進(jìn)展[J]. 李好勛,王國棟.  中國科學(xué):生命科學(xué). 2015(06)
[3]煙草重要基因篇:8.煙草P450基因[J]. 解敏敏.  中國煙草科學(xué). 2015(02)
[4]4個(gè)烤煙品種不同采收期煙葉腺毛密度和形態(tài)比較[J]. 張亞婕,徐瓊?cè)A,毛自朝,浦衛(wèi)瓊,李軍營,陳嚴(yán)平.  云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)). 2015(01)
[5]不同品種(系)烤煙西柏三烯二醇代謝差異研究[J]. 王冬,孫九哲,彭玉富,張小全,李麗華,宋洋洋,楊鐵釗.  中國煙草學(xué)報(bào). 2014(06)
[6]10個(gè)烤煙品種間的腺毛密度比較研究[J]. 薛曉明,侯森林,于麗杰.  安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2014(06)
[7]煙草腺毛及其分泌物西柏三烯醇類物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 韓錦峰,張志勇,劉華山,王曉軍,劉晗,毛官杰.  中國煙草學(xué)報(bào). 2013(05)
[8]烤煙腺毛的形態(tài)學(xué)觀察[J]. 張亞婕,徐瓊?cè)A,毛自朝,浦衛(wèi)瓊,李軍營,陳嚴(yán)平.  電子顯微學(xué)報(bào). 2013(05)
[9]外源MeJA誘導(dǎo)煙草葉面防御反應(yīng)[J]. 馮琦,王永,武東玲,魏躍偉,崔紅.  中國煙草科學(xué). 2013(05)
[10]植物角質(zhì)層蠟質(zhì)的化學(xué)組成研究綜述[J]. 曾瓊,劉德春,劉勇.  生態(tài)學(xué)報(bào). 2013(17)

博士論文
[1]煙草西柏三烯二醇積累的遺傳及生態(tài)響應(yīng)研究[D]. 王冬.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014

碩士論文
[1]AtPAP1基因在煙草中的過表達(dá)及花青素合成調(diào)控[D]. 武東玲.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[2]腺毛分泌物對(duì)烤煙香味物質(zhì)影響及水分調(diào)控作用的研究[D]. 李鵬飛.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006



本文編號(hào)：3501454