GRAS轉(zhuǎn)錄因子是植物特有轉(zhuǎn)錄因子,一般由保守的GRAS結(jié)構(gòu)域組成,與光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物生長發(fā)育及植物逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。水稻GRAS轉(zhuǎn)錄因子G540中含有2個RPT1結(jié)構(gòu)域和2個GRAS結(jié)構(gòu)域,系統(tǒng)進化分析和表達模式分析發(fā)現(xiàn),G540屬于GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族中的HAM亞家族,在水稻穗早期發(fā)育階段特異表達,推斷G540可能參與穗的早期分化或形態(tài)建成。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對G540進行定點編輯,構(gòu)建G540基因敲除載體并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種‘9522’,鑒定并獲得遺傳轉(zhuǎn)化植株。對轉(zhuǎn)化植株的靶序列進行分析發(fā)現(xiàn),9522G540-1在靶序列上缺失了第4位C堿基,9522G540-4在靶序列的第3位和第4位之間插入了一個A堿基,9522G540-2在G540的雙等位基因上出現(xiàn)了不同的突變,一條鏈在靶序列上缺失了第4位C堿基,另一條鏈在靶序列上缺失8個堿基。對G540突變后的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),9522^G540-1、9522^G540-2和9522^G540-4的RPT1和GRAS結(jié)構(gòu)域完全缺... 

【文章來源】：分子植物育種. 2020,18(14)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

水稻GRAS家族系統(tǒng)進化分析

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)共獲得了10株轉(zhuǎn)基因植株，其中9株在G540的靶位點處出現(xiàn)了突變，突變率達到90%。上述9株突變體中共存在3種不同突變類型(圖4)，其中9522G540-1突變類型的共有5株，占55.6%;9522G540-4突變類型的共有3株，占33.3%;9522G540-2突變類型的共有1株，占11.1%。進一步對G540突變類型分析發(fā)現(xiàn)(圖4)，未突變的G540編碼一個含有462個氨基酸的轉(zhuǎn)錄因子，其中兩個RPT1結(jié)構(gòu)域分別為第61位至第73位氨基酸基序和第117位至第129位氨基酸基序，GRAS結(jié)構(gòu)域為第173位至第460位氨基酸序列；9522G540-1在靶序列上缺失了第4位C堿基，導(dǎo)致移碼突變并提前終止翻譯，僅編碼出一個含有63個氨基酸的殘缺序列；9522G540-4在靶序列的第3位和第4位之間插入了一個A堿基，導(dǎo)致移碼突變并提前終止翻譯，僅編碼出一個含有18個氨基酸的殘缺序列；9522G540-2在G540的雙等位基因上出現(xiàn)了不同的突變，一條鏈在靶序列上缺失了第4位C堿基，導(dǎo)致移碼突變并提前終止翻譯，僅編碼出一個含有63個氨基酸的殘缺序列，而另一條鏈在靶序列上缺失8個堿基，導(dǎo)致移碼突變并提前終止翻譯，僅編碼出一個含有15個氨基酸的殘缺序列。突變位點、測序峰圖和氨基酸序列(圖4)。綜上分析可知，突變體9522G540-1、9522G540-2和9522G540-4不能正常翻譯G540蛋白序列，核心結(jié)構(gòu)域RPT1和GRAS完全缺失，導(dǎo)致G540功能缺陷，即成功獲得G540功能缺陷型突變體。2 討論

水稻GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族能夠參與光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物生長發(fā)育及植物逆境脅迫響應(yīng)等途徑，而影響水稻穗發(fā)育的GRAS轉(zhuǎn)錄因子卻未見報道。本研究前期利用水稻穗發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組分析獲得一個GRAS類型的轉(zhuǎn)錄因子G540，隸屬于HAM亞家族。在擬南芥中，HAM家族成員與莖尖分生組織和葉腋分生組織的發(fā)育進程息息相關(guān)(Li et al.,2003)。時空表達模式分析發(fā)現(xiàn)G540在水稻穗發(fā)育早期特異表達，表明G540可能參與莖頂端分生組織轉(zhuǎn)化幼穗發(fā)育、穗分化及形態(tài)建成等進程。CRISPR/Cas9系統(tǒng)為反向遺傳學(xué)研究及作物遺傳育種提供了高效便捷的研究方法及工具。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)化了G540的基因編輯載體，鑒定到3種以‘9522’為背景材料的G540功能缺陷型突變體，突變體均為靶序列突變導(dǎo)致移碼，提前終止翻譯。下一步通過顯微觀察突變體的幼穗分化及穗的發(fā)育，揭示G540在水稻幼穗發(fā)育過程中的生物學(xué)功能；進一步挖掘轉(zhuǎn)錄因子G540互作蛋白和下游基因，解析G540在水稻幼穗發(fā)育過程中的分子機制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究獲得的G540功能缺失突變體為深入研究G540在幼穗發(fā)育過程中的生物學(xué)功能和分子機制提供遺傳材料。

【參考文獻】：
期刊論文
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[3]植物轉(zhuǎn)錄因子GRAS蛋白的研究進展[J]. 牛義嶺,姜秀明,許向陽,李景富.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2016(09)
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本文編號：3421033