油橄欖HMGR基因家族的克隆表達及功能驗證
發(fā)布時間：2021-08-31 15:10
3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）,催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-Co A）生成甲羥戊酸（MVA）,是MVA途徑中第一個關鍵酶。油橄欖是一種重要的經濟油料作物,其含有的萜類物質具有重要營養(yǎng)價值,但關于調控萜類物質代謝途徑的關鍵基因研究較少。為研究萜類合成途徑關鍵酶基因HMGR,本研究采用RT-PCR法克隆油橄欖HMGR基因,進行生物信息學分析及構建原核表達載體,對表達蛋白生物活性進行功能驗證,并采用熒光定量PCR分析HMGR在油橄欖不同生長階段的表達量。結果表明:克隆出油橄欖HMGR基因家族的三個基因,分別命名為Oe HMGR1、Oe HMGR2、Oe HMGR3,m RNA ORF的長度分別為1 713 bp、1 773 bp、1 737 bp,編碼570、590、578個氨基酸;基因編碼蛋白均有2個跨膜區(qū)及HMGR催化活性的結構域,不含信號肽;構建了原核表達載體p ET30b（+）-Oe HMGR,轉入到大腸桿菌BL21中成功表達,3個重組酶蛋白分子量大小均在66.268.0 k D之間,分離純化重組蛋白進行功能驗證,GC-...
【文章來源】：基因組學與應用生物學. 2018,37(05)北大核心CSCD
【文章頁數】：10 頁
【部分圖文】：
OeHMGRs基因ORF區(qū)克隆注:M:MarkⅢ;1:OeHMGR1;2:OeHMGR2;3:OeHMGR3
溝腟OPMA分析顯示：在OeHMGR1蛋白的二級結構中，α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲、延伸鏈在結構中所占的比例分別為42.46%、7.37%、33.86%、16.32%；在OeHMGR2蛋白的二級結構中，α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲、延伸鏈所占比例分別為41.55%、7.76%、32.41%、18.28%；在OeHMGR3蛋白的二級結構中α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲、延伸鏈所占比例分別為37.76%、8.28%、34.83%、19.14%。以人類的HMGR基因(1dqa.1.A)為模板，利用SWISS-MODEL構建三級結構模型(圖3)，結果顯示，OeHMGR1、OeHMGR2、OeHMGR3編碼蛋白與人類的HMGR分別具有56.22%、56.81%、56.45%序列相似性的空間結構。1.3.3對OeHMGR編碼蛋白跨膜區(qū)與信號肽預測分析利用在線軟件TMHMMServer，v.2.0預測跨膜區(qū)結果表明：OeHMGR1蛋白含有2個跨膜區(qū)，一個位于A35~A57，另一個位于A78~A100；OeHMGR2蛋白含有2個跨膜區(qū)，位于A38~A60以及位于A81~A103的多肽鏈；OeHMGR3蛋白含有2個跨膜區(qū)，一個位于A26~A48，另一個位于A69~A91。使用SignalP程序預測OeHMGR1、OeHMGR2、OeHMGR3蛋白均不具有信號肽。1.3.4對OeHMGR編碼蛋白構建系統(tǒng)進化樹分析在GenBank數據庫挑選出25個物種的25條HMGR氨基酸序列與OeHMGR1、OeHMGR2、OeHM-GR3構建系統(tǒng)進化樹，通過使用MEGA5.0中的neighbor-joining方法(Larkinetal.,2007)，來源于不同物種的HMGR被聚成了古細菌、真菌、植物和動物四大類。古細菌包括：Thermococcusgammatol－eransEJ3(ACS33648)、Methanocaldococcusjannaschii(WP-010870211)、Methanospir
?錆捅曜?品5.6min處目標峰的質譜圖(圖11A;圖11B)，二者極為相似，說明反應組得到了產物甲瓦龍酸內酯，而對照組未檢測到此峰，表明OeHMGR純化蛋白參與催化了該反應，本研究克隆得到的cDNA編碼的蛋白具有HMGR酶的功能。1.5OeHMGR基因在油橄欖不同組織以及果實不同階段的表達分析1.5.1油橄欖不同組織中OeHMGR基因的表達分析熒光定量PCR分析不同組織中OeHMGR的表達量(圖12)，結果表明該基因在組織中的表達量果實>葉>花>根，其中果實和葉中的表達量較高，而在圖7OeHMGR2表達產物的SDS-PAGE分析Figure7SDS-PAGEanalysisofexpressedproductsofOeHMGR2的目的條帶最濃。經Ni-AgaroseHis標簽蛋白純化試劑盒純化的蛋白產物僅在該位置處單一明顯的條帶(圖9)，由此證實該條帶即為目的產物，表明重組OeHMGR基因家族在大腸桿菌中得到了成功表達。1.4.3蛋白酶功能驗證對照組、催化產物、標準品經乙酸乙酯萃取后上圖4HMGRS蛋白的系統(tǒng)進化樹Figure4PhylogenetictreeofHMGRsprotein圖6OeHMGR1表達產物的SDS-PAGE分析Figure6SDS-PAGEanalysisofexpressedproductsofOeHMGR1圖5重組質粒pET30b(+)-OeHMGR的酶切鑒定注:1:NotⅠ與KpnⅠ雙酶切重組質粒pET30b(+)-OeHMGR結果;2:NotⅠ酶切重組質粒pET30b(+)-OeHMGR結果;3:KpnⅠ酶切重組質粒pET30b(+)-OeHMGR結果;M:DNAMarkerⅢFigure5IdentificationofpET30b(+)-OeHMGRwithrestrictiondigestionNote:1:TheelectrophoreticresultofrecombinantplasmidpET30b(+)-OeHMGRdigestedbyNotⅠandKpnⅠtogether;2:Theelectrophoreticresultofrecombin
【參考文獻】：
期刊論文
[1]油橄欖葉中橄欖苦苷的體外抗氧化和抑菌活性[J]. 吳遵秋,姜友軍,蘇光燦,王安逸,陳華萍,楊澤身,黃乾明. 食品科學. 2014(21)
本文編號：3375114
【文章來源】：基因組學與應用生物學. 2018,37(05)北大核心CSCD
【文章頁數】：10 頁
【部分圖文】：
OeHMGRs基因ORF區(qū)克隆注:M:MarkⅢ;1:OeHMGR1;2:OeHMGR2;3:OeHMGR3
溝腟OPMA分析顯示：在OeHMGR1蛋白的二級結構中，α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲、延伸鏈在結構中所占的比例分別為42.46%、7.37%、33.86%、16.32%；在OeHMGR2蛋白的二級結構中，α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲、延伸鏈所占比例分別為41.55%、7.76%、32.41%、18.28%；在OeHMGR3蛋白的二級結構中α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲、延伸鏈所占比例分別為37.76%、8.28%、34.83%、19.14%。以人類的HMGR基因(1dqa.1.A)為模板，利用SWISS-MODEL構建三級結構模型(圖3)，結果顯示，OeHMGR1、OeHMGR2、OeHMGR3編碼蛋白與人類的HMGR分別具有56.22%、56.81%、56.45%序列相似性的空間結構。1.3.3對OeHMGR編碼蛋白跨膜區(qū)與信號肽預測分析利用在線軟件TMHMMServer，v.2.0預測跨膜區(qū)結果表明：OeHMGR1蛋白含有2個跨膜區(qū)，一個位于A35~A57，另一個位于A78~A100；OeHMGR2蛋白含有2個跨膜區(qū)，位于A38~A60以及位于A81~A103的多肽鏈；OeHMGR3蛋白含有2個跨膜區(qū)，一個位于A26~A48，另一個位于A69~A91。使用SignalP程序預測OeHMGR1、OeHMGR2、OeHMGR3蛋白均不具有信號肽。1.3.4對OeHMGR編碼蛋白構建系統(tǒng)進化樹分析在GenBank數據庫挑選出25個物種的25條HMGR氨基酸序列與OeHMGR1、OeHMGR2、OeHM-GR3構建系統(tǒng)進化樹，通過使用MEGA5.0中的neighbor-joining方法(Larkinetal.,2007)，來源于不同物種的HMGR被聚成了古細菌、真菌、植物和動物四大類。古細菌包括：Thermococcusgammatol－eransEJ3(ACS33648)、Methanocaldococcusjannaschii(WP-010870211)、Methanospir
?錆捅曜?品5.6min處目標峰的質譜圖(圖11A;圖11B)，二者極為相似，說明反應組得到了產物甲瓦龍酸內酯，而對照組未檢測到此峰，表明OeHMGR純化蛋白參與催化了該反應，本研究克隆得到的cDNA編碼的蛋白具有HMGR酶的功能。1.5OeHMGR基因在油橄欖不同組織以及果實不同階段的表達分析1.5.1油橄欖不同組織中OeHMGR基因的表達分析熒光定量PCR分析不同組織中OeHMGR的表達量(圖12)，結果表明該基因在組織中的表達量果實>葉>花>根，其中果實和葉中的表達量較高，而在圖7OeHMGR2表達產物的SDS-PAGE分析Figure7SDS-PAGEanalysisofexpressedproductsofOeHMGR2的目的條帶最濃。經Ni-AgaroseHis標簽蛋白純化試劑盒純化的蛋白產物僅在該位置處單一明顯的條帶(圖9)，由此證實該條帶即為目的產物，表明重組OeHMGR基因家族在大腸桿菌中得到了成功表達。1.4.3蛋白酶功能驗證對照組、催化產物、標準品經乙酸乙酯萃取后上圖4HMGRS蛋白的系統(tǒng)進化樹Figure4PhylogenetictreeofHMGRsprotein圖6OeHMGR1表達產物的SDS-PAGE分析Figure6SDS-PAGEanalysisofexpressedproductsofOeHMGR1圖5重組質粒pET30b(+)-OeHMGR的酶切鑒定注:1:NotⅠ與KpnⅠ雙酶切重組質粒pET30b(+)-OeHMGR結果;2:NotⅠ酶切重組質粒pET30b(+)-OeHMGR結果;3:KpnⅠ酶切重組質粒pET30b(+)-OeHMGR結果;M:DNAMarkerⅢFigure5IdentificationofpET30b(+)-OeHMGRwithrestrictiondigestionNote:1:TheelectrophoreticresultofrecombinantplasmidpET30b(+)-OeHMGRdigestedbyNotⅠandKpnⅠtogether;2:Theelectrophoreticresultofrecombin
【參考文獻】：
期刊論文
[1]油橄欖葉中橄欖苦苷的體外抗氧化和抑菌活性[J]. 吳遵秋,姜友軍,蘇光燦,王安逸,陳華萍,楊澤身,黃乾明. 食品科學. 2014(21)
本文編號：3375114
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