萜類是煙草重要的香氣物質(zhì)和前體物。為調(diào)控?zé)煵葺祁惖暮铣?將前期克隆的煙草NtDXR基因,分別進(jìn)行組織型過表達(dá)和腺毛特異性過表達(dá),經(jīng)DNA-PCR、RT-PCR、Southern Blot、GUS染色、qPCR檢測,獲得陽性株系,并進(jìn)行表型檢測、生理指標(biāo)檢測和基因表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下:1、將NtDXR融合綠色熒光蛋白（GFP）,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在煙草中瞬時表達(dá)NtDXR基因,檢測煙葉表皮細(xì)胞的綠色熒光,亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,NtDXR基因定位于葉綠體。2、構(gòu)建NtDXR基因的組成型過表達(dá)載體（pCAMBIA-35S-NtDXR-GUS）和腺毛特異過表達(dá)載體（pCAMBIA1391-CYP-NtDXR-GUS）,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入烤煙品種K326,經(jīng)卡那抗性篩選獲得煙株,對轉(zhuǎn)基因煙株進(jìn)行DNA-PCR、RT-PCR檢測,篩選出NtDXR過表達(dá)陽性轉(zhuǎn)基因株系。對NtDXR轉(zhuǎn)基因株系的煙葉進(jìn)行GUS染色,結(jié)果顯示,35S-NtDXR煙葉各組織均染成藍(lán)色,CYP-NtDXR煙葉只有腺毛染成藍(lán)色。3、對陽性NtDXR轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Southern blot分析,結(jié)果顯示,獲得的NtDXR組成... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：44 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

萜類化合物的結(jié)構(gòu)式

4發(fā)現(xiàn)，如果抑止擬南芥的MVA途徑，MEP途徑就會補(bǔ)充細(xì)胞質(zhì)中MVA途徑代謝流的減少。如今我們已經(jīng)知曉，單萜、二萜、四萜以及某些異戊二烯的醌類基本通過MEP途徑在質(zhì)體中獲得，而倍半萜、三萜等大都通過細(xì)胞質(zhì)中的MVA途徑獲得[31]。但是，最近有些試驗(yàn)認(rèn)為這兩條途徑合成的萜類物質(zhì)并不是絕對不變的。比如，番茄和青蒿腺毛中的MEP途徑也能合成倍半萜[32-33]，而巴豆的MEP途徑的產(chǎn)物中則出現(xiàn)了三萜[34]。MVA途徑也能合成穿心蓮內(nèi)酯(一種二萜內(nèi)酯化合物)的前體物[35]。此外，雖然IPP大多在細(xì)菌、藻類和植物體的MEP途徑形成，但在古細(xì)菌、真菌和動物體內(nèi)則是經(jīng)由MVA途徑獲得[36-37]。虛線表示由多步反應(yīng)完成圖2植物萜類生物合成的兩條途徑1.2.2MEP途徑關(guān)鍵酶研究進(jìn)展MEP途徑中研究最多的是DXS和DXR酶。DXS基因最初是在大腸桿菌中分離出來的[38]，之后又從薄荷[39]、胡椒[40]以及其他細(xì)菌[41]中分離出DXR的同源基因。這幾年的探索證明，植物和細(xì)菌中存在兩個或者多個DXS基因[42]，這表示該基因是以家族形式存在的[43]。金蓉等[44]已經(jīng)研究了DXS在MEP途徑中的功能、DXS的構(gòu)造、亞細(xì)胞定位、酶活性、編

164結(jié)果與分析4.1亞細(xì)胞定位DXR基因是萜類合成MEP途徑的關(guān)鍵酶，該途徑在質(zhì)體中進(jìn)行，為了了解煙草NtDXR在細(xì)胞中的定位情況，將NtDXR與GFP融合，連接在CaMV35S啟動子的下游，在煙草葉片中瞬時表達(dá)，通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察GFP綠色熒光在細(xì)胞中的分布，確定NtDXR基因在細(xì)胞中的表達(dá)部位。如圖3示，NtDXR-GFP融合蛋白激發(fā)的綠色熒光與葉綠素激發(fā)的紅色熒光位置重合，因此NtDXR定位于葉綠體。圖3亞細(xì)胞定位圖a:融合蛋白綠色熒光;b:葉綠素自發(fā)熒光;c:合并影像;d:明場像比例尺：20μm4.2NtDXR基因在煙草中的過表達(dá)4.2.1載體檢測4.2.1.1組成型過表達(dá)載體pCAMBIA-35S-NtDXR–GUS檢測將已構(gòu)建好的載體pCAMBIA-35S-NtDXR–GUS進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果如圖4A。然后用熱激法將組成型過表達(dá)載體pCAMBIA-35S-NtDXR–GUS，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行菌液PCR檢測，電泳結(jié)果見圖4B，陽性菌液可用來轉(zhuǎn)化無菌苗。圖4PCR檢測(A)M:markerDL2000;1:陰性對照;2:pCAMBIA-35S-NtDXR–GUS載體(B)M:markerDL2000;1:質(zhì)粒;2:陰性對照;3-4:農(nóng)桿菌菌液4.2.1.2腺毛特異性過表達(dá)載體pCAMBIA1391-CYP-NtDXR-GUS檢測將已構(gòu)建好的載體pCAMBIA1391-CYP-NtDXR-GUS進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果如圖5A。用熱激法將腺毛特異性過表達(dá)載體pCAMBIA1391-CYP-NtDXR-GUS，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行菌液PCR檢測，電泳結(jié)果見圖5B，陽性菌液可用來轉(zhuǎn)化無菌苗。(A)(B)(A)(B)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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