miRNA參與調控植物生長發(fā)育、生物或非生物脅迫等多種生物學過程,并發(fā)揮重要作用。近年來,通過高通量測序已鑒定篩選出大量的小麥miRNA,但其生物學功能是未知的。tae-miR9663和tae-miR5062是本實驗室前期鑒定出的新miRNA,它們在小麥幼苗、旗葉和發(fā)育的籽粒中都表達,尤其在旗葉中高表達。為了探索它們的功能,本研究通過克隆得到tae-miR9663和tae-miR5062的前體,通過人工合成得到tae-miR9663和tae-miR5062的小串聯(lián)模擬靶標（short tandem target mimic,STTM）,將它們分別構建到大麥條斑花葉病毒（barley stripe mosaic virus,BSMV）載體上,獲得重組病毒載體BSMV:tae-miR9663、BSMV:STTM9663、BSMV:tae-miR5062和BSMV:STTM5062;利用這些重組病毒分別接種寧春16小麥第3⁵片葉,在小麥葉片瞬時過表達或沉默目標miRNA,觀察侵染植株表型變化,并實時定量qRT-PCR檢測目標miRNA及其靶基因的豐度變化,探索miRNA... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

采用頸環(huán)引物反轉錄PCR的原理

4小麥旗葉高表達的tae-miR9663和tae-miR5062功能的初步研究加尾法是先在miRNA的3′末端加入poly（A）尾，然后加入含接頭序列的poly（T）進行逆轉錄反應，獲得有接頭的cDNA第一鏈，為后續(xù)PCR反應提供反向通用引物的序列，再利用miRNA特異性引物作為正向引物便可PCR擴增（ShiandChiang2005）（圖1-2）。此法也可用SYBRGreen染料定量檢測miRNA。Xue等（2009）使用這種方法分析了水稻籽粒相關的小RNA，鑒定出26個新的miRNA和12個候選miRNA。Yang等（2011）用此方法對高通量測序結果進行驗證，比較了地黃中89個保守的miRNA和6個新的miRNA。圖1-2采用加尾法進行qRT-PCR的原理Fig.1-2SchematicdescriptionofpolyAqRT-PCR1.1.3植物miRNA靶基因的預測及其實驗驗證miRNA通過調控其靶基因來發(fā)揮生物學功能，因此要研究miRNA的功能，首先要進行靶基因的鑒定。由于miRNA數(shù)量多，利用傳統(tǒng)的方法篩選靶基因效率很低，因而生物信息學技術成為預測靶基因的首要方法。結合植物miRNA和其靶基因高度匹配的特點，已有很多預測的軟件被設計出來，比如BLAST、miRU、psRNATarget以及PatScan等（易小婭等2015）。Barozai等（2012）通過序列比對和RNA-hybrid（Rehmsmeieretal.2004）軟件，預測出84個向日葵miRNA的靶基因。psRNATarget能夠根據(jù)評分情況來判斷miRNA和靶基因的互補程度，另外根據(jù)miRNA與靶基因結合的自由能可評價

8小麥旗葉高表達的tae-miR9663和tae-miR5062功能的初步研究白現(xiàn)象，但沒有出現(xiàn)在系統(tǒng)葉片中。所以，VIGS的有效性需要病毒的不斷復制與轉錄，以及大量的dsRNA來維持。圖1-3植物中病毒誘導的基因沉默的機制Fig.1-3Themechanismofvirus-inducedgenesilencinginplant1.3.2VIGS在植物基因功能中的研究VIGS技術由于具有多種優(yōu)勢而被廣泛應用，它的操作簡單，實驗周期較短，在植物當代就可觀察分析表型變化，不需要得到轉基因株系，并且能夠彌補傳統(tǒng)方法可能導致植物突變甚至死亡的不足，快速有效地鑒定基因功能（Burch-Smithetal.2004;王宏芝等2005;楊迎伍等2007）。1995年，Kumagai等研究人員首先將PDS基因片段連接到煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus,TMV）上侵染本氏煙草，發(fā)現(xiàn)其葉片白化，這種現(xiàn)象是由于類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵酶PDS基因被沉默，植物無法進行光保護作用而導致的。此后，有許多研究人員利用其他的病毒載體，比如PVX、TRV、棉花皺縮病毒（Cottonleafcrumplevirus,CLCrV）和大白菜曲葉病毒（Cabbageleafcurlvirus,CaLCuV）等對擬南芥、水稻、小麥、番茄（Liuetal.2002;Liuetal.2012;孫威等2015）等多種植物進行基因沉默，研究基因功能。Burton等（Burtonetal.2000）構建了植物細胞壁的纖維素合成酶基因（Cellulosesynthasegenes,CesA）與PVX的VIGS重組載體，

【參考文獻】：
期刊論文
[1]病毒誘導的基因沉默的發(fā)展及在植物生物逆境上的應用[J]. 姚丙晨,孫玥,孫林靜,馬忠友,蘇京平,劉學軍.  中國農(nóng)學通報. 2016(09)
[2]病毒誘導的基因沉默及其在植物研究中的應用[J]. 孫威,許奕,許桂鶯,孫佩光,宋順,常勝合.  生物技術通報. 2015(10)
[3]植物miRNA的研究方法概述[J]. 易小婭,楊瑞瑞,曾幼玲.  植物生理學報. 2015(04)
[4]miRNA的鑒定及檢測方法的概述[J]. 叢立新,張金玉,趙志輝.  飼料工業(yè). 2014(03)
[5]4條小麥保守MicroRNAs的表達譜分析及其靶基因預測[J]. 閆妍,韓冉,趙惠賢.  麥類作物學報. 2012(06)
[6]Virus-induced Gene Silencing in Eggplant（Solanum melongena）[J]. Haiping Liu,Daqi Fu,Benzhong Zhu,Huaxue Yan,Xiaoying Shen,Jinhua Zuo,Yi Zhu and Yunbo Luo Laboratory of Fruit Biology,College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China.  Journal of Integrative Plant Biology. 2012(06)
[7]病毒誘導的基因沉默技術及其在植物中的研究進展[J]. 張新華,李富軍.  西北植物學報. 2012(02)
[8]病毒誘導的基因沉默及其在植物功能基因組研究中的應用[J]. 黃昌軍,錢亞娟,李正和,周雪平.  中國科學:生命科學. 2012(01)
[9]利用BSMV-VIGS技術快速分析小麥TNBL1基因的抗黃矮病功能[J]. 趙丹,趙繼榮,黃茜,李寧,劉艷,黃占景,張增艷.  作物學報. 2011(11)
[10]高表達miR396小分子導致擬南芥花柱頭彎曲[J]. 劉冬梅,楊鳳璽,余迪求.  云南植物研究. 2009(04)



本文編號：3338947