細胞周期活動是生物體最基本的生理活動之一,細胞周期調(diào)控因子（CDC48）通過激活周期蛋白依賴激酶（CDK）參與調(diào)控細胞分裂。細胞分裂活動的重啟與植物體細胞胚胎發(fā)生能力的獲得和愈傷組織脫分化狀態(tài)的維持密切相關(guān)。本研究以小麥品種科農(nóng)199（KN199）為材料,通過同源比對克隆得到小麥的細胞周期調(diào)控基因TaCDC48,通過對TaCDC48進行分子生物學(xué)分析以及轉(zhuǎn)基因功能鑒定,以期進一步明確細胞周期調(diào)控基因?qū)w細胞胚胎發(fā)生的影響,以及TaCDC48在提高植物細胞分裂效率方面的作用。主要研究結(jié)果如下:1、小麥TaCDC48基因的克隆及表達特性分析。利用同源比對技術(shù)克隆得到小麥TaCDC48基因,TaCDC48在小麥生長旺盛的幼穗及胚性愈傷中的表達量高于其他組織,且能夠在小麥愈傷組織誘導(dǎo)和分化的早期階段響應(yīng)表達。2、TaCDC48和TaSERK1蛋白的互作驗證。同時利用酵母雙雜交技術(shù)和雙分子熒光互補技術(shù)證明了TaCDC48和TaSERK1的互作關(guān)系,二者在細胞質(zhì)中發(fā)生互作,暗示,TaCDC48可能通過與TaSERK1蛋白的相互作用,以形成復(fù)合物形式參與植物體細胞胚胎發(fā)生過程。3、TaCDC48轉(zhuǎn)基... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

CDC48蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖

8小麥細胞周期調(diào)控基因TaCDC48的克隆和功能分析1.6選題的目的和意義小麥（Triticumaestivum)是我國重要的糧食作物之一，分子育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種為小麥育種提供了新的研究方向。目前，人們已經(jīng)能夠利用小麥的花藥(Hanetal.2010)、幼胚、成熟胚(zgenetal.1998)等外植體獲得再生植株。但是不同基因型的小麥體外培養(yǎng)往往在胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、分化等方面表現(xiàn)出較大差異。研究發(fā)現(xiàn)，植物組織脫分化與細胞周期的重建相關(guān)，細胞重新進入分裂狀態(tài)標(biāo)志著細胞脫分化的開始，細胞脫分化狀態(tài)的維持和胚胎發(fā)生離不開活躍的細胞分裂(Grafi2004)。因此研究小麥體細胞胚胎發(fā)生過程中的細胞周期調(diào)控對于完善小麥體細胞胚胎發(fā)生的作用機制進而提高小麥組織培養(yǎng)的再生率具有一定意義。細胞周期調(diào)控是生物體重要的生理活動，而CDC48又是細胞周期調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因，目前僅在擬南芥、水稻、龍眼等少數(shù)幾種植物中克隆到該基因，在小麥中尚未見該基因報道。本研究通過對小麥細胞周期調(diào)控基因（TaCDC48）的克隆及分子特性分析，并通過驗證其與小麥體細胞胚胎發(fā)生受體類激酶基因（TaSERK1）的互作關(guān)系，為進一步明確小麥TaCDC48基因的功能及其參與小麥體細胞胚胎發(fā)生過程的分子機制提供參考。1.7技術(shù)路線圖1-2技術(shù)路線

20小麥細胞周期調(diào)控基因TaCDC48的克隆和功能分析第三章結(jié)果與分析3.1TaCDC48基因的克隆根據(jù)NCBI和EnsemblPlant數(shù)據(jù)庫中小麥基因組數(shù)據(jù)，得到小麥細胞周期調(diào)控基因的候選序列TaCDC48，以KN199小麥cDNA為模板，以TaCDC48F和TaCDC48R為引物，擴增得到如圖3-1所示條帶。經(jīng)測序分析顯示該條帶為小麥細胞周期調(diào)控基因TaCDC48的cDNA序列。利用NCBI數(shù)據(jù)庫的ORFFinder預(yù)測顯示TaCDC48為完整的ORF(openreadingframe)。序列分析結(jié)果表明，TaCDC48由2442個堿基組成，編碼813個氨基酸，分子量為85kD，等電點為5.15，預(yù)測顯示，TaCDC48的gDNA序列包含10個外顯子和9個內(nèi)含子。圖3-1：TaCDC48基因克攏M：SuperMaker；1：目標(biāo)條帶。Figure3-1:CloningofTaCDC48gene.M:SuperMarker;1:Thetargetgene.3.2生物信息學(xué)分析對不同物種間細胞周期調(diào)控蛋白（CDC48）的進化關(guān)系分析，結(jié)果顯示，在進化關(guān)系上，普通小麥的細胞周期調(diào)控蛋白與烏拉爾圖小麥的細胞周期調(diào)控蛋白親緣關(guān)系最近，除此之外禾本科之間的細胞周期調(diào)控蛋白親緣關(guān)系都較近（圖3-2B）。在Phyre網(wǎng)站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)預(yù)測TaCDC48蛋白三級結(jié)構(gòu)如圖3-2A。根據(jù)DNAMAN的序列比對結(jié)果，可以看出細胞周期調(diào)控蛋白是生物體內(nèi)高度保守的蛋白（圖3-4）。利用DOG2.0軟件對13個物種的細胞周期調(diào)控蛋白進行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)不同物種間細胞周期調(diào)控蛋白都含有一個N端結(jié)構(gòu)域、一個CDC48結(jié)構(gòu)域、兩個高度保守的ATP酶結(jié)構(gòu)域D1和D2，但C端結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)不同，與小麥親緣關(guān)系最近的烏拉爾圖小麥細胞周期調(diào)控蛋白CDC48含有C端結(jié)構(gòu)域，而在普通小麥中卻不含有C端結(jié)構(gòu)域（圖3-3）。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]酵母雙雜交技術(shù)及應(yīng)用的研究進展[J]. 鄭立雙,李向楠,孫城濤,劉紅羽,劉勛,賀明,呂文發(fā).  中國畜牧獸醫(yī). 2013(09)
[2]流式細胞儀在植物科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用及方法舉例[J]. 黃秀清,郭偉志,馬志慧,任艷,張幸幸,黃小丹,丁國昌.  安徽農(nóng)學(xué)通報. 2013(11)
[3]利用流式細胞儀研究擬南芥葉發(fā)育過程中細胞周期的調(diào)控[J]. 曾民環(huán),許德陽,薛景石,袁振環(huán),黃海,崔曉峰.  植物生理學(xué)報. 2012(09)
[4]植物體細胞胚胎發(fā)生受體類蛋白激酶的生物學(xué)功能[J]. 石雅麗,張銳,林芹,郭三堆.  遺傳. 2012(05)
[5]雙分子熒光互補技術(shù)[J]. 樊晉宇,崔宗強,張先恩.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2008(08)
[6]高等植物體細胞胚胎發(fā)生的研究進展[J]. 周鍵,孫建波,彭明.  中國農(nóng)學(xué)通報. 2008(02)
[7]Isolation, characterization and functional analysis of a cdc48 homologue from tobacco BY-2 cells[J]. CHEN Zhiling, YU Yi, LIU Lina and XIA Guixian ( College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100037, China; Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China).  Progress in Natural Science. 2007(02)
[8]小麥體細胞胚發(fā)生中DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成動態(tài)[J]. 崔凱榮,王曉哲,陳雄,王亞馥.  核農(nóng)學(xué)報. 1997(04)

博士論文
[1]小麥組織培養(yǎng)再生相關(guān)基因克隆及分子特性分析[D]. 佘茂云.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2011

碩士論文
[1]煙草細胞周期相關(guān)基因NtCDC48的克隆與功能研究[D]. 劉麗娜.首都師范大學(xué) 2006



本文編號：3320675