發(fā)布時(shí)間：2021-07-05 08:47

　　藜麥（Chenopodium quinoa.Wild）是鹽生植物,因其獨(dú)特的生物學(xué)特性及全面的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值逐漸成為越來(lái)越多生物學(xué)家的研究對(duì)象。隨著藜麥全基因組序列信息的解析,越來(lái)越多藜麥功能基因逐漸被克隆,但用于藜麥的CRISPR/Cas9基因組編輯體系還未見(jiàn)報(bào)道,這一定程度上限制了藜麥的基因功能研究。乙酰-5-羥色胺甲基轉(zhuǎn)移酶（Acetylserotonin methyltransferase,ASMT）是褪黑素生物合成的最后一種酶,在植物褪黑激素的產(chǎn)生中起著限速作用,編碼ASMT蛋白的基因通常以多基因家族的形式存在,近年來(lái)越來(lái)越多研究表明,提高ASMT基因的表達(dá)水平可以提高植物對(duì)逆境抗性,但ASMT基因突變后的表型及生理影響還不清楚。為此,本研究開(kāi)展了三部分的工作,首先對(duì)藜麥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)的條件進(jìn)行了摸索確定,為篩選構(gòu)建藜麥CRISPR/Cas9系統(tǒng)所需的U6啟動(dòng)子奠定基礎(chǔ);其次,對(duì)藜麥不同U6啟動(dòng)子進(jìn)行克隆,構(gòu)建表達(dá)載體篩選高轉(zhuǎn)錄活性的藜麥U6啟動(dòng)子;最后對(duì)藜麥ASMT基因家族進(jìn)行系統(tǒng)分析,確定了ASMT靶標(biāo)基因,并利用篩選得到的U6啟動(dòng)子構(gòu)建藜麥ASMT基因的CRISPR/Cas... 

【文章來(lái)源】：煙臺(tái)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：80 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

煙臺(tái)大學(xué)碩士學(xué)位論文13圖2高等植物褪黑素的合成和代謝途徑（王蕊等2016）Figure2Biosynthesisandmetabolismpathwayofmelatonininhigherplant3.3植物中褪黑素合成基因ASMT的研究進(jìn)展褪黑素生物合成的最后一步由ASMT催化,該酶和動(dòng)物褪黑素合成途徑中HIOMT高度同源。Kang等首次在水稻中克隆了ASMT,序列分析表明該酶屬于O-甲基轉(zhuǎn)移酶家族,其中18個(gè)編碼OMT的cDNA與小麥COMT高度同源，將這些cDNA與大腸桿菌重組并進(jìn)行表達(dá),發(fā)現(xiàn)只有AK072740基因具有合成褪黑素的能力,進(jìn)一步研究表明衰老和外源脅迫因素可以誘導(dǎo)ASMT的表達(dá)[93]。在煙草中異源過(guò)量表達(dá)AANAT和HIOMT基因可以提高煙草褪黑素含量，并一定程度緩解UVB對(duì)DNA造成的損傷[94]。Park等首次在大腸桿菌中純化了水稻OsASMT并進(jìn)行了酶動(dòng)力學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)黑暗環(huán)境下褪黑素含量顯著高于光照,并且這種上調(diào)與OsASMT的表達(dá)相一致，這表明植物中ASMT基因的表達(dá)可能與動(dòng)物中類似，受到光周期或晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)[95]。隨后對(duì)水稻ASMT基因家族的ASMT1(AK072740)、ASMT2(AK069308)及ASMT3(AAL34945)進(jìn)行的功能分析表明,這3個(gè)基因的表達(dá)均受ABA和MeJA的誘導(dǎo),但是這些ASMT的催化活性處于較低水平,因此不適宜通過(guò)調(diào)控這些酶的表達(dá)或外源轉(zhuǎn)入相關(guān)基因來(lái)提高植物褪黑素含量[96]。Zuo等克隆了編碼蘋(píng)果ASMT的基

第一章藜麥原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的建立20量才能達(dá)到合適水平。本實(shí)驗(yàn)比較了0.4-0.8M甘露醇作為穩(wěn)滲劑制備原生質(zhì)體的效果，結(jié)果（圖2-1圖2-2）表明：低甘露醇濃度下（0.4M-0.5M）,原生質(zhì)體的產(chǎn)量較低，存活率也處于較低水平，部分細(xì)胞在洗滌過(guò)程中因吸水而漲破；當(dāng)甘露醇濃度達(dá)到0.6M時(shí)，原生質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)外滲透壓趨于平衡，原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)到峰值，活性最高，原生質(zhì)體形態(tài)飽滿，葉綠體分布均勻，洗滌過(guò)程中只有少量破損；當(dāng)甘露醇濃度繼續(xù)增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性均開(kāi)始下降，部分細(xì)胞因失水而皺縮。綜上，0.6M甘露醇作為藜麥原生質(zhì)體制備過(guò)程中的穩(wěn)滲劑最佳。圖2-1不同甘露醇濃度下原生質(zhì)體產(chǎn)率和存活率Figure2-1Theyieldandviabilityofprotoplastawithdifferentmannitolconcentrations注：酶成分為1.5%纖維素酶+0.3%離析酶，酶解時(shí)間為8h圖中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±SD圖2-2不同甘露醇濃度下原生質(zhì)體形態(tài)Figure2-2Themorphologyofprotoplastswithdifferentmannitolconcentrations

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[5]棉花不同GbU6啟動(dòng)子截短克隆及功能鑒定[J]. 雷建峰,李月,徐新霞,阿爾祖古麗·塔什,蒲艷,張巨松,劉曉東.  作物學(xué)報(bào). 2016(05)
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[10]刺葡萄原生質(zhì)體分離研究[J]. 呂長(zhǎng)平,石雪暉,徐艷,葉云.  湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2005(04)

博士論文
[1]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的玉米基因組定點(diǎn)編輯研究[D]. 朱金潔.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]基于CRISPR/Cas9的擬南芥多基因編輯及其在基因功能研究中的應(yīng)用[D]. 劉玟杉.重慶大學(xué) 2015

碩士論文
[1]百合原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)的研究[D]. 柳玉晶.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006



本文編號(hào)：3265755