發(fā)布時間：2021-07-05 08:47

　　藜麥（Chenopodium quinoa.Wild）是鹽生植物,因其獨特的生物學特性及全面的營養(yǎng)價值逐漸成為越來越多生物學家的研究對象。隨著藜麥全基因組序列信息的解析,越來越多藜麥功能基因逐漸被克隆,但用于藜麥的CRISPR/Cas9基因組編輯體系還未見報道,這一定程度上限制了藜麥的基因功能研究。乙酰-5-羥色胺甲基轉移酶（Acetylserotonin methyltransferase,ASMT）是褪黑素生物合成的最后一種酶,在植物褪黑激素的產生中起著限速作用,編碼ASMT蛋白的基因通常以多基因家族的形式存在,近年來越來越多研究表明,提高ASMT基因的表達水平可以提高植物對逆境抗性,但ASMT基因突變后的表型及生理影響還不清楚。為此,本研究開展了三部分的工作,首先對藜麥原生質體瞬時表達的條件進行了摸索確定,為篩選構建藜麥CRISPR/Cas9系統(tǒng)所需的U6啟動子奠定基礎;其次,對藜麥不同U6啟動子進行克隆,構建表達載體篩選高轉錄活性的藜麥U6啟動子;最后對藜麥ASMT基因家族進行系統(tǒng)分析,確定了ASMT靶標基因,并利用篩選得到的U6啟動子構建藜麥ASMT基因的CRISPR/Cas... 

【文章來源】：煙臺大學山東省

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas系統(tǒng)結構

煙臺大學碩士學位論文13圖2高等植物褪黑素的合成和代謝途徑（王蕊等2016）Figure2Biosynthesisandmetabolismpathwayofmelatonininhigherplant3.3植物中褪黑素合成基因ASMT的研究進展褪黑素生物合成的最后一步由ASMT催化,該酶和動物褪黑素合成途徑中HIOMT高度同源。Kang等首次在水稻中克隆了ASMT,序列分析表明該酶屬于O-甲基轉移酶家族,其中18個編碼OMT的cDNA與小麥COMT高度同源，將這些cDNA與大腸桿菌重組并進行表達,發(fā)現(xiàn)只有AK072740基因具有合成褪黑素的能力,進一步研究表明衰老和外源脅迫因素可以誘導ASMT的表達[93]。在煙草中異源過量表達AANAT和HIOMT基因可以提高煙草褪黑素含量，并一定程度緩解UVB對DNA造成的損傷[94]。Park等首次在大腸桿菌中純化了水稻OsASMT并進行了酶動力學分析,發(fā)現(xiàn)黑暗環(huán)境下褪黑素含量顯著高于光照,并且這種上調與OsASMT的表達相一致，這表明植物中ASMT基因的表達可能與動物中類似，受到光周期或晝夜節(jié)律的調節(jié)[95]。隨后對水稻ASMT基因家族的ASMT1(AK072740)、ASMT2(AK069308)及ASMT3(AAL34945)進行的功能分析表明,這3個基因的表達均受ABA和MeJA的誘導,但是這些ASMT的催化活性處于較低水平,因此不適宜通過調控這些酶的表達或外源轉入相關基因來提高植物褪黑素含量[96]。Zuo等克隆了編碼蘋果ASMT的基

第一章藜麥原生質體瞬時轉化體系的建立20量才能達到合適水平。本實驗比較了0.4-0.8M甘露醇作為穩(wěn)滲劑制備原生質體的效果，結果（圖2-1圖2-2）表明：低甘露醇濃度下（0.4M-0.5M）,原生質體的產量較低，存活率也處于較低水平，部分細胞在洗滌過程中因吸水而漲破；當甘露醇濃度達到0.6M時，原生質體細胞內外滲透壓趨于平衡，原生質體的產量達到峰值，活性最高，原生質體形態(tài)飽滿，葉綠體分布均勻，洗滌過程中只有少量破損；當甘露醇濃度繼續(xù)增加，原生質體的產量和活性均開始下降，部分細胞因失水而皺縮。綜上，0.6M甘露醇作為藜麥原生質體制備過程中的穩(wěn)滲劑最佳。圖2-1不同甘露醇濃度下原生質體產率和存活率Figure2-1Theyieldandviabilityofprotoplastawithdifferentmannitolconcentrations注：酶成分為1.5%纖維素酶+0.3%離析酶，酶解時間為8h圖中數(shù)據(jù)為3次重復的平均值±SD圖2-2不同甘露醇濃度下原生質體形態(tài)Figure2-2Themorphologyofprotoplastswithdifferentmannitolconcentrations

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]CRISPR-Cas9介導的玉米基因組定點編輯研究[D]. 朱金潔.中國農業(yè)大學 2015
[2]基于CRISPR/Cas9的擬南芥多基因編輯及其在基因功能研究中的應用[D]. 劉玟杉.重慶大學 2015

碩士論文
[1]百合原生質體分離及培養(yǎng)的研究[D]. 柳玉晶.東北農業(yè)大學 2006



本文編號：3265755