甘蔗是重要的糖料和能源作物,也是很多工業(yè)產(chǎn)品的原料來源,但是中國(guó)的甘蔗80%以上種植在旱坡地上,缺乏灌溉條件,干旱己經(jīng)成為制約我國(guó)甘蔗生產(chǎn)和蔗糖業(yè)發(fā)展的重要因素。基于此,我們?cè)谇叭斯ぷ鞯幕A(chǔ)上,從廣西自育的抗旱性較強(qiáng)的桂糖21號(hào)（GT21）甘蔗品種中克隆了甘蔗△1-吡咯啉-5-竣酸合成酶基因（SoP5CS）,并對(duì)其序列特征進(jìn)行了分析,通過熒光定量PCR分析了其在甘蔗不同組織及在不同處理下的表達(dá)特性;通過構(gòu)建SoP5CS基因的原核表達(dá)載體,使目的蛋白在大腸桿菌中表達(dá),蛋白經(jīng)純化后制備了單克隆抗體;通過構(gòu)建基因的植物表達(dá)載體,遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗和煙草進(jìn)行過量表達(dá)研究。本研究希望通過綜合研究SoP5CS的抗旱功能,為進(jìn)一步利用該基因改良甘蔗及其他作物的抗旱性提供必要的研究基礎(chǔ)和參考依據(jù)。本研究所獲得的主要結(jié)果如下:1.運(yùn)用RT-PCR技術(shù),從GT21甘蔗葉片中克隆了 SoP5CS基因全長(zhǎng),獲得了在NCBI上登陸號(hào)為KJ546350.1 的基因序列。該基因具有2151bp完整的開放閱讀框,編碼716個(gè)氨基酸,所編碼的蛋白質(zhì)分子量為77.72 kDa;是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、不具有跨膜結(jié)構(gòu)的親水性蛋白。其核苷... 

【文章來源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：112 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫表
1 前言
    1.1 干旱脅迫與植物的生理生化基礎(chǔ)
        1.1.1 干旱脅迫與植物抗氧化系統(tǒng)
        1.1.2 干旱脅迫與植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)
        1.1.3 干旱脅迫與植物細(xì)胞膜系統(tǒng)
        1.1.4 干旱脅迫與植物內(nèi)源激素
    1.2 干旱脅迫與植物基因
        1.2.1 干旱脅迫與植物基因的調(diào)控
        1.2.2 植物干旱響應(yīng)基因的挖掘
        1.2.3 植物抗旱基因的功能研究
    1.3 植物P5CS基因研究進(jìn)展
        1.3.1 植物P5CS基因的克隆與表達(dá)特性研究
        1.3.2 植物P5CS基因在抗逆基因工程中的應(yīng)用
    1.4 甘蔗轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展
        1.4.1 甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化方法
        1.4.2 甘蔗抗逆轉(zhuǎn)基因研究
    1.5 本研究的立論依據(jù)、研究目的及意義
    1.6 本研究的技術(shù)路線
2 SoP5CS基因的克隆及序列分析
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌種及載體
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 甘蔗幼苗葉片總RNA的提取及檢測(cè)
        2.2.2 cDNA第一鏈的合成
        2.2.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增
        2.2.4 目的條帶的膠回收純化
        2.2.5 SoP5CS片段的連接及測(cè)序驗(yàn)證
        2.2.6 生物信息學(xué)分析
    2.3 結(jié)果分析
        2.3.1 提取的總RNA質(zhì)量檢測(cè)
        2.3.2 SoP5CS基因的擴(kuò)增
        2.3.3 SoP5CS基因的生物信息學(xué)相關(guān)分析
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 SoP5CS基因表達(dá)量分析
    3.1 材料
        3.1.1 植物材料及處理
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
    3.2 實(shí)驗(yàn)主要方法
        3.2.1 RNA的提取及檢測(cè)
        3.2.2 基因組DNA的去除及cDNA的合成
        3.2.3 SoP5CS基因熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)
        3.2.4 熒光定量PCR
    3.3 結(jié)果分析
        3.3.1 RNA和cDNA質(zhì)量的檢測(cè)
        3.3.2 SoP5CS的組織表達(dá)特性
        3.3.3 SoP5CS在不同處理下的表達(dá)特性
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
4 SoP5CS的原核表達(dá)、蛋白純化及單克隆抗體制備
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 載體及菌株
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 pET-30a載體質(zhì)粒的提取
        4.2.2 目的基因與載體的雙酶切
        4.2.3 目的基因片段與原核表達(dá)載體的連接及轉(zhuǎn)化
        4.2.4 重組質(zhì)粒pET30a-SoP5CS的提取及雙酶切驗(yàn)證
        4.2.5 重組質(zhì)粒pET30a-SoP5CS轉(zhuǎn)化BL21
        4.2.6 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.2.7 SDS-PAGE電泳
        4.2.8 原核表達(dá)的SoP5CS蛋白的純化
        4.2.9 單克隆抗體的制備及鑒定
    4.3 結(jié)果分析
        4.3.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證
        4.3.2 原核表達(dá)
        4.3.3 原核表達(dá)蛋白的純化
        4.3.4 單克隆抗體的制備
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
5 甘蔗過量表達(dá)SoP5CS基因的研究
    5.1 材料
        5.1.1 甘蔗材料
        5.1.2 農(nóng)桿菌及植物表達(dá)載體
        5.1.3 主要試劑
        5.1.4 培養(yǎng)基
        5.1.5 主要的儀器設(shè)備
    5.2 方法
        5.2.1 植物表達(dá)載體引物的設(shè)計(jì)
        5.2.2 SoP5CS基因ORF的擴(kuò)增及回收
        5.2.3 PUBTB質(zhì)粒的提取
        5.2.4 目的基因片段和載體質(zhì)粒的雙酶切及純化
        5.2.5 SoP5CS與植物表達(dá)載體的連接及轉(zhuǎn)化
        5.2.6 重組質(zhì)粒的提取及酶切驗(yàn)證
        5.2.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌
        5.2.8 甘蔗組培材料的抗性篩選
        5.2.9 甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化
        5.2.10 轉(zhuǎn)基因甘蔗基因組DNA的提取
        5.2.11 轉(zhuǎn)基因甘蔗的PCR檢測(cè)
        5.2.12 轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗旱研究
    5.3 結(jié)果分析
        5.3.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建
        5.3.2 PPT的抗性篩選
        5.3.3 轉(zhuǎn)基因甘蔗的獲得
        5.3.4 轉(zhuǎn)基因甘蔗的PCR檢測(cè)
        5.3.5 轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗旱性鑒定
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
6 SoP5CS基因轉(zhuǎn)化煙草的研究
    6.1 材料
        6.1.1 煙草材料
        6.1.2 菌種及載體
        6.1.3 主要試劑
        6.1.4 培養(yǎng)基
        6.1.5 主要儀器設(shè)備
    6.2 方法
        6.2.1 煙草無菌苗的培養(yǎng)及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
        6.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草DNA的提取
        6.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)
        6.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的基因拷貝數(shù)測(cè)定
        6.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性檢測(cè)
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得
        6.3.2 轉(zhuǎn)基因煙草的檢測(cè)
        6.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草的基因拷貝數(shù)測(cè)定
        6.3.4 轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性檢測(cè)
    6.4 討論
    6.5 小結(jié)
7 結(jié)論
    7.1 全文結(jié)論
    7.2 論文創(chuàng)新點(diǎn)
    7.3 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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[8]虉草耐鹽性鑒定及P5CS基因克隆[D]. 叢麗麗.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[9]大豆凝集素基因lec-s的克隆及轉(zhuǎn)化煙草的研究[D]. 郭佩佩.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[10]二球懸鈴木花發(fā)育相關(guān)基因功能的初步驗(yàn)證及遺傳轉(zhuǎn)化[D]. 易雙雙.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3189618