花生是世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要油料作物,我國花生的年產(chǎn)量居世界首位,花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,但是花生的基礎(chǔ)理論研究進程明顯滯后于其他作物。葉綠體是光合作用的重要場所,作為植物的能量轉(zhuǎn)換站,在植物的生長發(fā)育中具有舉足輕重的地位。葉色突變體可對光合效率產(chǎn)生一定影響,由于其表型特征明顯,易于辨別而被應用于育種和分子標記輔助選擇中。葉色突變體已在水稻等多種植物中得到研究和應用,但在花生中還未見報道。本研究從EMS誘變創(chuàng)建的花生突變體庫中篩選出黃綠和白綠葉色突變體,并分析了其在不同發(fā)育時期生理指標的變化、細胞顯微結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量差異;同時重點分析了八氫番茄紅素脫氫酶（AhPDS）基因,對其理化性質(zhì)和功能進行了預測,并構(gòu)建了Ah20PDS基因的CRISPR-Cas9表達載體,利用農(nóng)桿菌介導方法轉(zhuǎn)入花生幼苗植株中,通過此技術(shù)對花生AhPDS基因?qū)崿F(xiàn)定點敲除編輯,為進一步研究該基因功能和葉色表型分子育種奠定基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下:（1）花生黃綠突變體和白綠突變體在不同發(fā)育時期葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素均比野生型有所降低,其中在苗期和盛花期葉綠素降低最為顯著;葉綠素熒光動力學參數(shù)分析表明,主要參數(shù)Fv/Fm、... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學河南省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
第一章 文獻綜述
    1.1 葉色突變體
        1.1.1 葉色突變體的分類
        1.1.2 葉綠體色素含量
        1.1.3 熒光動力學分析
        1.1.4 突變體葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化
        1.1.5 葉色突變體的應用前景
    1.2 類胡蘿卜素簡介
        1.2.1 類胡蘿卜素的功能
        1.2.2 類胡蘿卜素的生物合成途徑
        1.2.3 類胡蘿卜素合成過程中的主要酶
            1.2.3.1 八氫番茄紅素合成酶(PSY)
            1.2.3.2 ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ZDS)
            1.2.3.3 番茄紅素
            1.2.3.4 八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)
    1.3 Crispr cas9技術(shù)
    1.4 本研究的目的意義
第二章 葉色突變體農(nóng)藝性狀分析
    2.1 試驗材料與方法
        2.1.1 試驗材料
        2.1.2 材料的種植
    2.2 試驗方法
        2.2.1 葉片色素含量的測定
        2.2.2 葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察
            2.2.2.1 試劑的配制
            2.2.2.2 實驗步驟
        2.2.3 葉片熒光動力學分析
        2.2.4 葉色突變體表型性狀和產(chǎn)量性狀的分析
        2.2.5 統(tǒng)計分析方法
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量的分析
        2.3.2 不同葉色突變體的超微結(jié)構(gòu)觀察
        2.3.3 不同葉色突變體的葉綠素熒光參數(shù)分析
        2.3.4 不同葉色突變體的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量性狀分析
    2.4 結(jié)論與討論
第三章 花生AhPDS基因的克隆與分子特性分析
    3.1 實驗材料
        3.1.1 供試材料
        3.1.2 菌株與質(zhì)粒
        3.1.3 試劑耗材
        3.1.4 主要儀器和設(shè)備
        3.1.5 主要試劑的配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 花生基因組DNA的提取
        3.2.2 花生總RNA的提取
        3.2.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        3.2.4 花生AhPDS基因的克隆
            3.2.4.1 引物的設(shè)計與合成
            3.2.4.2 花生AhPDS的m RNA和 DNA全長序列的PCR擴增
            3.2.4.3 目的片段的純化回收
            3.2.4.4 目的片段與PMD19-T載體的連接
            3.2.4.5 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
            3.2.4.6 目的基因的轉(zhuǎn)化
            3.2.4.7 菌液PCR的檢測
            3.2.4.8 花生AhPDS基因的生物信息學分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 花生AhPDS基因的克隆
        3.3.2 花生AhPDS基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學分析
            3.3.2.1 花生AhPDS基因的c DNA序列分析
            3.3.2.2 花生AhPDS基因編碼的蛋白質(zhì)序列分析
            3.3.2.3 花生AhPDS基因編碼的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾分析
            3.3.2.4 AhPDS蛋白的亞細胞定位
            3.3.2.5 花生AhPDS蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域預測
            3.3.2.6 花生AhPDS蛋白的同源性分析
    3.4 結(jié)論與討論
第四章 花生AhPDS基因的CRISPR-CAS9 表達載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化
    4.1 試驗材料
        4.1.1 供試材料
        4.1.2 菌株與質(zhì)粒
        4.1.3 試劑耗材
        4.1.4 主要試劑的配置
        4.1.5 DNA測序
    4.2 試驗方法
        4.2.1 總RNA的提取及c DNA的合成
        4.2.2 基因組DNA的提取
        4.2.3 CRISPR-Cas9 載體的構(gòu)建
            4.2.3.1 CRISPR-Cas9 靶點選擇
            4.2.3.2 花生AhPDS基因sgRNA靶位點序列引物的設(shè)計
            4.2.3.3 靶位點處寡聚核苷酸鏈片段及sgRNAcassette的At U6-26-sgRNA-SK載體的處理:
            4.2.3.4 sgRNA cassette的構(gòu)建
            4.2.3.5 植物表達載體pCAMBIA1300-pYAO:Cas9 的構(gòu)建
            4.2.3.6 構(gòu)建好的sgRNA-Cas9載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌載體LBA4404 中及驗證
        4.2.4 農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化
            4.2.4.1 農(nóng)桿菌介導的花生轉(zhuǎn)化
            4.2.4.2 轉(zhuǎn)基因植株幼嫩葉片的PCR檢測
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 花生AhPDS基因靶位點的查找及確定
        4.3.2 攜帶pds基因靶位點的sgRNA載體的鑒定
        4.3.3 sgRNA-Cas9載體的構(gòu)建
        4.3.4 轉(zhuǎn)基因植株葉片表型特征
    4.4 結(jié)論與討論
參考文獻
附錄
Abstract



本文編號：3178811