冬凌草（Isodon rubescens）為唇形科香茶菜屬多年生草本植物,傳統(tǒng)用藥部位為干燥地上部分,常用于治療咽喉腫痛、慢性肝炎、關(guān)節(jié)風(fēng)濕痛、氣管炎等疾病。近年來,由于其較好的抗癌活性備受關(guān)注。其主要的抗癌活性物質(zhì)為冬凌草甲素、冬凌草乙素等成分,屬于對映貝殼杉烷型類二萜化合物。傳統(tǒng)的以原植物為基礎(chǔ)的生產(chǎn)模式大大限制了其推廣使用,以合成生物學(xué)的手段來生產(chǎn)藥用活性成分的方法有望打破這種限制,但這種方法必須以明確化合物在植物體內(nèi)的代謝途徑為前提。本研究綜合利用轉(zhuǎn)錄組、表達(dá)譜、蛋白體外功能鑒定、同源建模及定點突變等技術(shù)系統(tǒng)克隆鑒定了參與冬凌草甲、乙素等二萜類化合物生物合成的二萜合酶基因。發(fā)現(xiàn)冬凌草存在擴(kuò)張的類貝殼杉烷合酶基因家族,并借此闡明了唇形科中特殊結(jié)構(gòu)類貝殼杉烷合酶的進(jìn)化歷程。同時在冬凌草中發(fā)現(xiàn)了首例由可變剪切引起二萜合酶產(chǎn)物變化的證據(jù),為二萜化合物多樣性進(jìn)化提供了新的視角。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:1.通過對冬凌草葉片組織的轉(zhuǎn)錄組測序、數(shù)據(jù)分析,共篩選到11個候選二萜合酶基因,進(jìn)一步利用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)克隆獲得了這些基因的cDNA全長。對基因的開放閱讀框進(jìn)行分析,獲... 

【文章來源】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞列表
前言
第一章 冬凌草二萜合酶基因的克隆及分析
    1.1 材料與方法
        1.1.1 植物材料
        1.1.2 菌株與載體
        1.1.3 實驗試劑
        1.1.4 主要儀器
        1.1.5 冬凌草各組織RNA的提取
        1.1.6 候選二萜合酶基因的篩選
        1.1.7 目的基因全長的克隆及測序
        1.1.8 目的基因生物信息學(xué)分析及蛋白功能預(yù)測
        1.1.9 目的基因組織特異性表達(dá)分析
    1.2 結(jié)果與分析
        1.2.1 RNA提取結(jié)果
        1.2.2 轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析
        1.2.3 目的基因cDNA的獲得
        1.2.4 目的基因分子序列初步分析
        1.2.5 目的蛋白功能預(yù)測
        1.2.6 組織特異性表達(dá)分析
    1.3 討論
第二章 冬凌草Ⅱ型二萜合酶基因的原核表達(dá)及功能研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 菌種與載體
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 目的基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.1.5 目的蛋白的原核表達(dá)
        2.1.6 重組蛋白的純化
        2.1.7 蛋白檢測和定量
        2.1.8 重組蛋白的功能鑒定
        2.1.9 IrCPS3 定點突變研究
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 目的基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        2.2.3 目的蛋白的功能鑒定
        2.2.4 IrCPS3 定點突變研究
    2.3 討論
第三章 冬凌草Ⅰ型二萜合酶基因的原核表達(dá)及功能研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 菌種與載體
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 目的基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.5 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
        3.1.6 目的蛋白的功能鑒定
        3.1.7 酶促動力學(xué)分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 目的基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        3.2.3 重組蛋白的功能鑒定
        3.2.4 IrKSL6 雙功能酶促動力學(xué)分析
    3.3 討論
第四章 IrKSL3 基因可變剪切研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 植物材料、菌種及載體
        4.1.2 主要試劑及儀器
        4.1.3 基因序列分析
        4.1.4 重組蛋白的功能鑒定
        4.1.5 定點突變研究
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 基因及氨基酸序列分析
        4.2.2 IrKSL3a生化功能鑒定
        4.2.3 突變體生化功能鑒定
        4.2.4 蛋白同源序列分析
    4.3 討論
結(jié)語
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
博士研究生期間所發(fā)表論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3174218