發(fā)布時(shí)間：2020-11-07 10:41

　　 冬蟲夏草Ophiocordyceps sinensis是麥角菌科冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體。具有“補(bǔ)腎益肺,止咳化痰”之功效,是一種名貴中藥。由于其生理生化的特殊性和復(fù)雜性,目前其子實(shí)體形成機(jī)制研究得并不明確。本研究利用Illumina/Solexa HiSeq 2500反轉(zhuǎn)錄測(cè)序技術(shù)對(duì)冬蟲夏草子實(shí)體、菌絲體及小金蝠蛾幼蟲轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序、數(shù)據(jù)組裝、分析,發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草菌絲體、子實(shí)體與冬蟲夏草具有高同源性,而小金蝠蛾幼蟲與其他樣品的同源性很低;差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)9238個(gè)基因在冬蟲夏草菌絲體、子實(shí)體中均有表達(dá),這相當(dāng)于72.57%的重合度;經(jīng)鑒定,1003個(gè)基因?yàn)镈EGs(差異表達(dá)基因),KEGG富集分析顯示這些DEGs富含核糖體途徑;有161個(gè)差異表達(dá)基因參與豐富了GO術(shù)語(yǔ)。子實(shí)體中有58個(gè)差異表達(dá)基因下調(diào),103個(gè)差異表達(dá)基因上調(diào),表明冬蟲夏草蛋白質(zhì)合成的基本代謝在冬蟲夏草菌感染小金蝠蛾幼蟲后發(fā)生了改變,以及47個(gè)基因特異表達(dá);還發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白和微管蛋白相關(guān)基因表達(dá)的改變可能在子實(shí)體發(fā)育中起作用。這些結(jié)果均與冬蟲夏草子實(shí)體形成相關(guān)。同時(shí)利用2-DE(雙向電泳)技術(shù)對(duì)冬蟲夏草的發(fā)育過(guò)程中的三個(gè)階段(菌蟲復(fù)合體、子座、整體)的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析,篩選出5個(gè)穩(wěn)定存在的蛋白質(zhì)和3個(gè)具有顯著差異的蛋白質(zhì),這8種蛋白質(zhì)均在子座形成后出現(xiàn)。通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)一步鑒定了這8個(gè)蛋白質(zhì),對(duì)其進(jìn)行功能注釋分析(GO、KEGG)后發(fā)現(xiàn),3個(gè)具有顯著差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)1、斑點(diǎn)5、斑點(diǎn)6均與細(xì)胞構(gòu)成相關(guān),其中斑點(diǎn)1參與大量核苷酸結(jié)合和酶活性過(guò)程,斑點(diǎn)5參與了大量代謝過(guò)程和化合物結(jié)合過(guò)程,斑點(diǎn)6參與了大量代謝過(guò)程和細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程;5個(gè)穩(wěn)定存在的蛋白質(zhì)中斑點(diǎn)2、斑點(diǎn)3與刺激應(yīng)答、核苷三磷酸酶結(jié)合相關(guān),斑點(diǎn)4與有機(jī)氮化合物代謝、離子結(jié)合相關(guān),斑點(diǎn)7與生物調(diào)節(jié)和水解酶活性相關(guān),斑點(diǎn)8與物質(zhì)運(yùn)輸和轉(zhuǎn)錄合成相關(guān)。斑點(diǎn)1鑒定為肌動(dòng)蛋白,GO注釋發(fā)現(xiàn)該蛋白大量參與了細(xì)胞、細(xì)胞區(qū)域、細(xì)胞組分、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)部分等過(guò)程,KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)其活躍的代謝途徑為磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、吞噬小體,提示肌動(dòng)蛋白可能在冬蟲夏草的生長(zhǎng)發(fā)育中其重要作用。還通過(guò)2-DE(雙向電泳)技術(shù)對(duì)野生冬蟲夏草整體、菌蟲復(fù)合體、子座及人工冬蟲夏草整體、菌蟲復(fù)合體、子座的蛋白質(zhì)組進(jìn)行對(duì)比分析,篩選出野生冬蟲夏草特有的蛋白質(zhì),驗(yàn)證了課題組前期冬蟲夏草正偽品指標(biāo)性蛋白質(zhì),并基于蛋白質(zhì)層面揭示了野生冬蟲夏草與人工培育冬蟲夏草間的差異,為后續(xù)野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草的鑒別研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S567.35
【部分圖文】：

53.3 差異表達(dá)和功能富集分析將冬蟲夏草菌絲體組和子實(shí)體組的所有 RNA-Seq PE 讀數(shù)分別與 O.sinensisCO18(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000448365.1/)的基因組序列比對(duì)，并由 StringTie 組裝。總共組裝了 11264 個(gè)基因組編碼基因和 233 個(gè)新基因。為了全面表征不同樣品 RNA-Seq 的表達(dá)模式，將每個(gè)基因的比對(duì)讀數(shù)的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9238 個(gè)基因在冬蟲夏草菌絲體、子實(shí)體、小金蝠蛾幼蟲及冬圖 1.從冬蟲夏草菌絲體和子實(shí)體獲取的四個(gè)樣本的 KOG 分類和表達(dá)分析 A：裝配基因的 KOG 分類;B：六個(gè)樣品 RNA-Seq 的主成分分析; C：表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的維恩圖。Figure. 1. KOG classification and expression analysis of four samples from mycelium and Fruiting body ofOphiocordyceps sinensis. A: KOG classification of assembly genes; B: principal component analysis ofRNA-seq in six samples; C: Venn diagram expressing transcripts.

GO 富集也證實(shí)了這一結(jié)果。DEGs 的主要 GO 術(shù)語(yǔ)包括大分子復(fù)合物（102 個(gè)基因），有機(jī)物質(zhì)生物合成過(guò)程（88 個(gè)基因），生物合成過(guò)程（88 個(gè)基因），細(xì)胞生物合成過(guò)程（81 個(gè)基因）和有機(jī)氮化合物代謝過(guò)程（81 個(gè)基因），見圖 2。DEGs 的富集分析發(fā)現(xiàn)劇烈變化的基因主要富集在核糖體的結(jié)構(gòu)成分、核糖體亞基、蛋白酶體核心復(fù)合體、MCM 復(fù)合體、核糖核蛋白復(fù)合體途徑。有 161 個(gè)差異表達(dá)基因參與豐富了 GO 術(shù)語(yǔ)。 子實(shí)體中有 58 個(gè)基因下調(diào)，另外 103 個(gè)基因上調(diào)。這些結(jié)果表明，冬蟲夏草蛋白質(zhì)合成的基本代謝在冬蟲夏草菌感染小金蝠蛾幼蟲后發(fā)生改變。分析發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草中還有 47 個(gè)基因特異表達(dá)（特異表達(dá)基因，SEG），包括非核糖體肽合成酶，細(xì)胞色素 P450，HSP70 家族伴侶，乙醛酸酶家族蛋白，細(xì)胞壁相關(guān)蛋白，乙醛酸酶家族蛋白和 推定的琥珀酰-CoA 連接酶編碼基因。GO 分類結(jié)果表明，有 8 個(gè)特異表達(dá)基因與細(xì)胞部分相關(guān)。并且有 62 個(gè)基因在菌絲體中特異性表達(dá)，包括膜聯(lián)蛋白，核糖體 RNA 加工蛋白 12 編碼基因。

3.5 肌動(dòng)蛋白和微管蛋白相關(guān)基因肌動(dòng)蛋白基因(MSTRG.3317)的表達(dá)水平在冬蟲夏草中平均表達(dá)豐度為 45.25，菌絲體組平均表達(dá)豐度為 155.24。微管蛋白/ FtsZ 蛋白編碼基因(MSTRG.3823，MSTRG.689管蛋白/ FtsZ 家族蛋白(EQL01373.1)編碼序列。子實(shí)體和菌平均表達(dá)水平分別為 1748.13 和 574.04。MSTRG.6894 為微基因表達(dá)從菌絲體組的 27.18 上調(diào)至子實(shí)體組的 78.95。表蛋白相關(guān)基因表達(dá)的改變可能在子實(shí)體發(fā)育中起作用。圖 3 子實(shí)體發(fā)育候選基因的表達(dá)模式。根據(jù) HemI 工具包的 log2FC 值繪制表達(dá)水平計(jì)算 CS 樣品組和 HH 樣品組之間的 Log2FC。Figure. 3.Expression patterns of candidate genes for fruiting body development.Heat maps are drawn based on the log2FC values of the HemI toolkit. The Log2set and the HH sample set was calculated based on the expression level of each g
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2873829