甘草為我國最常用的大宗藥材之一,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品,具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等作用,市場需求量巨大。《中華人民共和國藥典》(2015版)明確規(guī)定:按干燥品計算,甘草中甘草苷(C21H2209)含量不得少于0.5%。但經(jīng)課題組前期調(diào)查研究,市售甘草藥材質(zhì)量良莠不齊,存在大量甘草苷含量不達標樣品。查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase,CHI)為甘草苷生物合成途徑中的第二個關(guān)鍵酶及限速酶,對于調(diào)控甘草中黃酮類化合物的積累具有重要意義。因此,本文圍繞CHI基因展開研究,擬揭示甘草CHI基因多態(tài)性調(diào)控黃酮類化合物生物合成的分子機制,以期指導(dǎo)優(yōu)質(zhì)甘草的分子育種。本論文以60株甘草樣品作為實驗材料,首先利用HPLC法測定其4種主要黃酮類化合物(甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素)的含量,篩選出含量最高的6株及含量最低的5株甘草樣品,作為后續(xù)基因分析的實驗材料;利用RT-PCR法對11株黃酮高/低含量甘草樣品進行CHI基因擴增,并對其進行多態(tài)性分析,篩選出黃酮高/低含量組樣品CHI基因主流單倍型;利用生物信息學(xué)軟件對主流CHI基因單倍型進行分析;構(gòu)建重組畢赤酵母表達載體pPIC9K-CHI;利用電轉(zhuǎn)法將重組后表達載體導(dǎo)入畢赤酵母GS115中;以甲醇為誘導(dǎo)劑對重組酵母工程菌G-P-CHI進行誘導(dǎo)表達,采用SDS-PAGE對表達產(chǎn)物進行檢測;分別以異甘草素及柚皮素查爾酮為底物,以表達產(chǎn)物CHI為粗酶進行體外酶促反應(yīng),采用HPLC法對酶促反應(yīng)產(chǎn)物進行定量分析。本論文取得的研究結(jié)果如下:(1)甘草CHI基因的克隆及多態(tài)性分析結(jié)果:11株黃酮高/低含量組樣品中共計獲得113條長度為690bp的CHI基因cDNA序列,編碼229個氨基酸殘基。經(jīng)DNAMAN比對分析,113條CHI cDNA序列的一致性為99.64%,存在97個變異位點,可分為53種單倍型(單倍型1～53);113條CHI氨基酸序列的一致性為99.10%,存在63個變異位點,可分為44種氨基酸序列類型(AA-1～AA-44)。單倍型1～7為同義突變序列,編碼AA-1;單倍型36～39為同義突變序列,編碼AA-30。66條黃酮高含量組樣品的CHI序列中,單倍型1數(shù)量為30,占比45.45%,為其主流單倍型;47條黃酮低含量組樣品的CHI序列中,單倍型36數(shù)量為25,占比53.19%,為其主流單倍型。單倍型1與單倍型36僅在246bp處存在C/A顛換。(2)甘草黃酮高/低含量組CHI主流單倍型(單倍型1與單倍型36)的生物信息學(xué)分析結(jié)果:黃酮高含量組主流單倍型1與黃酮低含量組主流單倍型36所對應(yīng)氨基酸序列類型AA-1與AA-30性質(zhì)差異較小,僅在理化性質(zhì)方面略有差異。二級結(jié)構(gòu)功能元件及三級結(jié)構(gòu)模板均一致,差異位點246bp位于底物結(jié)合區(qū)域外。AA-1與AA-30均不含信號肽、為查爾酮異構(gòu)酶超家族成員、不含跨膜結(jié)構(gòu)域、CHI蛋白位于膜外。與其他物種CHI序列的聚類分析結(jié)果表明AA-1與AA-30進化關(guān)系較近且與其他物種間區(qū)分良好。(3)轉(zhuǎn)甘草特異性CHI基因畢赤酵母GS115工程菌的構(gòu)建及表達分析:以pPIC9K為表達載體,構(gòu)建了攜帶黃酮高含量組主流CHI基因型(單倍型1)的畢赤酵母GS115工程菌G-P-CHI-1及攜帶黃酮低含量組主流CHI基因型(單倍型36)的畢赤酵母GS115工程菌G-P-CHI-36,對其進行His+轉(zhuǎn)化子篩選、遺傳霉素G418篩選、Mut+型重組子篩選、PCR驗證及測序驗證后,利用甲醇對成功構(gòu)建的工程菌進行誘導(dǎo)表達,利用SDS-PAGE對表達產(chǎn)物進行檢測,得到與甘草CHI蛋白理論大小一致(24kDa)的產(chǎn)物,證明誘導(dǎo)表達成功。(4)CHI的體外酶促反應(yīng):分別以異甘草素及柚皮素查爾酮為酶促反應(yīng)底物,以誘導(dǎo)表達得到的CHI蛋白為粗酶進行體外酶促反應(yīng)。利用HPLC法對酶促反應(yīng)后產(chǎn)物含量進行檢測,結(jié)果表明誘導(dǎo)表達得到的CHI蛋白具有催化活性,且CHI-1的催化效率優(yōu)于CHI-36,即黃酮高含量組主流單倍型的催化效率優(yōu)于黃酮低含量組主流單倍型。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S567.71
【部分圖文】：

ｕｉｈｈ??圖??圖１－１部分甘草總ＲＮＡ電泳圖??注：１？４為＿ＲＮＡ樣品，Ｍ為Ｍａｒｋｅｒ??３．２?ＰＣＲ擴增結(jié)果??以反轉(zhuǎn)錄獲得的ｃＤＮＡ為模板，丨Ｆ與丨Ｒ為引物，ＰＣＲ擴增獲得了長約６９０?ｂｐ的特??異條帶，與目標基因長度一致，如圖１－２所示。??圖１－２部分甘草樣品Ｃ／／／片段ＰＣＲ擴增結(jié)果??注：１？３為部分甘草樣品的ＰＣＲ擴增產(chǎn)物，Ｍ為Ｍａｒｋｅｒ??將ＰＣＲ產(chǎn)物直接送測序，結(jié)果顯示所得片段長度為６９０?ｂｐ，將該片段在ＮＣＢ丨的??ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫中進行ＢＬＡＳＴ比對分析后發(fā)現(xiàn)，該片段與其他物種Ｃ／／／序列相似度較??高（圖１－３），表明該序列為甘草ＣＷ／序列。??２９??

３．２?ＰＣＲ擴增結(jié)果??以反轉(zhuǎn)錄獲得的ｃＤＮＡ為模板，丨Ｆ與丨Ｒ為引物，ＰＣＲ擴增獲得了長約６９０?ｂｐ的特??異條帶，與目標基因長度一致，如圖１－２所示。??圖１－２部分甘草樣品Ｃ／／／片段ＰＣＲ擴增結(jié)果??注：１？３為部分甘草樣品的ＰＣＲ擴增產(chǎn)物，Ｍ為Ｍａｒｋｅｒ??將ＰＣＲ產(chǎn)物直接送測序，結(jié)果顯示所得片段長度為６９０?ｂｐ，將該片段在ＮＣＢ丨的??ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫中進行ＢＬＡＳＴ比對分析后發(fā)現(xiàn)，該片段與其他物種Ｃ／／／序列相似度較??高（圖１－３），表明該序列為甘草ＣＷ／序列。??２９??

３．３陽性克隆篩選結(jié)果??采用２．５中所述方法，對挑取的陽性克隆進行菌液ＰＣＲ驗證，瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果??如圖１－４所示，絕大部分的陽性克隆均擴增得到目的基因條帶。將ＰＣＲ擴增結(jié)果為陽性??的菌液送測序。??■ＷＰＷＵＬｂｐ??ｍｍｉ＇??圖１－４部分菌液ＰＣＲ驗證結(jié)果圖??注：１？７為囷液樣品，Ｍ為Ｍａｒｋｅｒ??３．４測序結(jié)果及分析??３．４．１甘草Ｃ／／／單倍型分析??１１株甘草樣品共克隆得到１１３條Ｃ７／／基因ｃＤＮＡ序列，測序結(jié)果顯示編碼區(qū)全長??為６９０?ｂｐ；?ＤＮＡＭＡＮ比對分析顯示１１３條序列中存在９７個變異位點，可分為５３種單??倍型
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本文編號：2867553