苦蕎(Fagopyrum tataricum)是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的雜糧作物,種植苦蕎不僅可以滿足自身的食用需求,還可以帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。隨著土壤鹽堿化的加重,苦蕎的種植面臨著很大的挑戰(zhàn),研究苦蕎的耐鹽機(jī)制,提高苦蕎的耐鹽性很有必要。本研究通過(guò)高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina Hiseq 2500對(duì)鹽分處理后的苦蕎幼苗進(jìn)行高通量測(cè)序,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,對(duì)組裝的Unigene進(jìn)行功能注釋,然后比對(duì)了苦蕎對(duì)照樣本與鹽脅迫處理樣本之間的轉(zhuǎn)錄本差異,以此確定苦蕎參與鹽脅迫響應(yīng)的潛在調(diào)節(jié)因子,對(duì)深入了解苦蕎耐鹽網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.苦蕎幼苗經(jīng)過(guò)0.2 moL/L NaCl溶液脅迫處理24小時(shí)后,相對(duì)含水量由85.28%降低到了83.52%,表現(xiàn)為顯著差異(0.01p0.05),相對(duì)電導(dǎo)率含量、丙二醛含量、SOD活性和POD活性分別提升了53.2%、25.9%、10%、40%,且都表現(xiàn)出極顯著差異(p0.01)。2.對(duì)拼接好的Unigene進(jìn)行功能注釋,其中共有30500(52.65%)、21064(36.36%)、20859(36.01%)、11791(20.35%)、23445(40.47%)、11206(19.34%)和20834(35.96%)個(gè)Unigene分別注釋到Genebank NR、Genebank NT、Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG和GO數(shù)據(jù)庫(kù)中。這些Unigene在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中劃分到三大GO功能分類的56個(gè)GO亞類中,在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)劃分到25個(gè)功能組中,KEGG分類則涉及到了273條代謝通路。3.預(yù)測(cè)了可能參與鹽分應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子,鑒定出3107個(gè)Unigene,劃分到93個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中,占比最大的是C2H2、WD40-like以及MYB-HB-like家族。4.進(jìn)行了差異表達(dá)基因分析,在455個(gè)差異表達(dá)基因中,404個(gè)Unigenes在鹽分處理后表達(dá)上調(diào),51個(gè)Unigene在鹽分處理后表達(dá)下調(diào)。GO富集分析顯示363個(gè)差異表達(dá)基因富集于25個(gè)GO亞類中,KEGG富集分析顯示差異表達(dá)基因富集于抗原處理和呈現(xiàn)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工等代謝通路中。5.進(jìn)行了SSR序列分析,共鑒定出6176個(gè)潛在的SSR,分布于5455個(gè)Unigene中,最豐富的重復(fù)類型是單核苷酸重復(fù)與三核苷酸重復(fù),其中A/T序列重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)最多。6.隨機(jī)挑選14個(gè)差異表達(dá)基因并設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量PCR,驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果基本一致,表明測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。7.通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行同源分析,結(jié)合已報(bào)道的抗鹽相關(guān)基因的研究,篩選出可能涉及苦蕎鹽分應(yīng)答的62個(gè)基因,這些基因涉及蛋白激酶、磷酸酶、熱休克蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)移酶、非生物相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和生物鐘的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
【學(xué)位單位】：成都大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S517
【部分圖文】：

圖 3.1 鹽分脅迫對(duì)苦蕎生理指標(biāo)的影響Fig.3.1 Efferts of salt stress on physiological indicatorsin buckwheat注：A 代表相對(duì)水含量的變化，B 代表相對(duì)電導(dǎo)率的變化，C 代表丙二醛含量的變化，D 代表氧化物歧化酶的變化，E 代表過(guò)氧化物酶的變化。*代表差異顯著（0.01<p<0.05），**代表差異極著（p<0.01）。對(duì)川蕎一號(hào)幼苗在正常情況下生長(zhǎng)以及在經(jīng)過(guò) 0.2moL/L NaCl 溶液脅迫 24 小時(shí)后植株材料進(jìn)行了取材，并測(cè)定與植物鹽分脅迫響應(yīng)相關(guān)的幾個(gè)生理指標(biāo)（圖 3.1）。過(guò)對(duì)苦蕎幼苗相對(duì)含水量的變化的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照的苦蕎幼苗，處理后幼苗的對(duì)含水量顯著降低，由 85.28%降低到了 86.52%，但都維持在 80%以上的較高水平。分脅迫后相對(duì)電導(dǎo)率由 4.7 % 增加至 7.2 %，鹽分處理相對(duì)于對(duì)照提升了 53.2%，表出極顯著的差異。在鹽分處理后，苦蕎幼苗中丙二醛含量由 21.8nmol·g-1FW 升高至.8nmol·g-1FW，相對(duì)增加了 25.9% ，并且表現(xiàn)出極顯著差異，相應(yīng)的，苦蕎幼苗在鹽脅迫響應(yīng)中過(guò)氧化酶防御系統(tǒng)的活動(dòng)也活躍了起來(lái)，其中超氧化物歧化酶的活性從正情況下 995.9U·g-1FW 增加到了 1058.1U·g-1FW，相對(duì)提升了 10%左右，過(guò)氧化物酶

成都大學(xué)碩士學(xué)位論文的變化更為明顯，酶活性由 12.1U·min-1·g FW 提高到了 18.2U·min-1·g FW，增加了 40%左右，兩種過(guò)氧化酶的活性提高均表現(xiàn)出了極顯著差異。總的來(lái)說(shuō)，在 0.2moL/L NaCl溶液處理 24 小時(shí)候后，苦蕎幼苗的生理活動(dòng)發(fā)生了明顯的變化。3.2 總 RNA 質(zhì)量鑒定將提取的總 RNA 通過(guò) 1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果出現(xiàn)了清晰的 28S、18S 和 5S條帶（圖 3.2），結(jié)果說(shuō)明提取的苦蕎 RNA 完整性較高，同時(shí)不存在自身基因組的污染，通過(guò)核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定，對(duì)照以及鹽分處理樣本的 A260/A280 均在 1.8~2.1 范圍內(nèi)，RNA 中蛋白的污染可以容忍，A260/230 均在 2.1~2.5 范圍內(nèi)，說(shuō)明有糖類、鹽類、有機(jī)溶劑、等污染較少，提取的 RNA 可以進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

圖 3.3 unigenes 長(zhǎng)度分布圖Fig.3.3 Length distribution of unigenesnigenes 功能注釋nigenes 功能注釋概況盡可能的注釋組裝得到的 Unigene 數(shù)據(jù)，將每個(gè) Unigene 序列與 Geneban NT、Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG 和 GO 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(表 3.3）。，在 57，921 個(gè) Unigenes 中，有 30，500 個(gè) Unigenes(占總 Unigenes 的 52ank NR 中被成功比對(duì)，在共 6 個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)注釋中，匹配度最高。在 Pf功比對(duì) 20，859 個(gè) Unigenes(占總 Unigenes 的 36.01%)，Genebank NT 數(shù)據(jù) 21，064 個(gè) Unigenes(占總 Unigenes 的 36.36%),SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中成功比nigenes(占總 Unigenes 的 40.47%)。而通過(guò)使用 Blast2GO v2.5，我們發(fā)現(xiàn)nigenes(占總 Unigenes 的 35.96%)與 GO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知蛋白質(zhì)成功比對(duì)。是 KEGG 和 KOG 數(shù)據(jù)庫(kù)，共有 11，206 個(gè) Unigenes(占總 Unigenes 的 19 數(shù)據(jù)庫(kù)成功比對(duì)，11，791 個(gè) Unigenes(占總 Unigenes 的 20.35%)與 KOG
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2866253