半夏[Pinellia ternate(Thunb.)Beri.],為天南星科半夏屬多年生草本植物。以干燥塊莖入藥,具有降逆止嘔、清熱化痰、解毒抗炎、鎮(zhèn)咳抗腫瘤功效,是我國(guó)現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)鏈重點(diǎn)研究利用的大宗藥材之一。但半夏在生產(chǎn)中存在嚴(yán)重的連作障礙問(wèn)題,傳統(tǒng)同一塊地間隔7-8年以上才可復(fù)種,嚴(yán)重制約了區(qū)域經(jīng)濟(jì)、土地永續(xù)利用及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。越來(lái)越多研究表明:半夏化感物質(zhì)及根際微生物群落結(jié)構(gòu)的破壞是其連作障礙形成的主要原因。因此,本研究以半夏連作—輪作系統(tǒng)中不同根區(qū)化感物質(zhì)及微生物群落變化為重點(diǎn)進(jìn)行研究,確定半夏連作地經(jīng)輪作小麥后化感物質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律,探明半夏潛在化感物質(zhì)及根際微生物與連作障礙之間的關(guān)系,為緩解半夏連作障礙提供理論依據(jù)。取得的主要研究結(jié)果:1、輪作小麥3年基本恢復(fù)了半夏的生理指標(biāo)、質(zhì)量指標(biāo)及有效成分含量。結(jié)果表明:小麥輪作3年,半夏各生長(zhǎng)時(shí)段株高、葉面積均顯著高于連作1年,倒苗率顯著低于連作1年,與對(duì)照土壤相比無(wú)顯著差異;輪作3年后半夏產(chǎn)量高于連作1年接近對(duì)照;輪作3年后,塊莖中水分、酸不溶性灰、浸出物等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)高于連作1年,其中浸出物含量顯著增加;可溶性糖、還原糖、琥珀酸、生物堿、鳥苷等有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于連作1年,且可溶性糖含量顯著增加。2、確定了半夏根際土壤中的8種酚酸物質(zhì)對(duì)半夏產(chǎn)生較強(qiáng)的化感作用。對(duì)連作3年半夏根際土壤和非連作土壤中的酚酸物質(zhì)進(jìn)行提取,LC-MS鑒定,共鑒識(shí)到17種酚酸類物質(zhì)。經(jīng)過(guò)對(duì)比和結(jié)合文獻(xiàn),確定了沒(méi)食子酸、原兒茶酸、香草酸、丁香酸、香蘭素、丁香醛、阿魏酸、綠原酸等8種物質(zhì)可能對(duì)半夏生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生較強(qiáng)的化感作用。進(jìn)一步考察以上8種酚酸類物質(zhì)對(duì)半夏發(fā)芽的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),有7種酚酸對(duì)半夏發(fā)芽率及萌發(fā)指數(shù)有抑制作用。阿魏酸對(duì)半夏發(fā)芽率具有促進(jìn)作用,且隨著濃度的增大,促進(jìn)作用增強(qiáng)。3、小麥與半夏輪作降低了半夏根際土壤中酚酸類物質(zhì)的含量。采用HPLC方法分析了半夏連作-輪作系統(tǒng)根際與根面土壤中總酚酸和8種單一酚酸物質(zhì)含量。結(jié)果表明,(1)半夏連作后,總酚酸含量隨連作時(shí)間的延長(zhǎng)而遞增,與對(duì)照相比呈極顯著差異;輪作小麥修復(fù)后,總酚酸顯著減少,輪作根際土壤中總酚含量大于根面土壤。(2)輪作小麥降低了連作半夏土壤中各酚酸含量。半夏連作根際和根面土壤中8種單一酚酸含量均高于對(duì)照和輪作土壤;根面土壤中大部分酚酸低于根際土壤含量。與連作土壤相比,輪作后的7種酚酸平均含量降低了50%,并由根面向根際進(jìn)行了動(dòng)態(tài)遷移。各酚酸的變化與輪作年限之間呈現(xiàn)第1年降低,然后第2年逐漸升高,到第3年開始穩(wěn)定的模式。4、外源抗氧化劑抗壞血酸(ASC)或龍膽二糖(gentiobiose),可顯著緩解連作半夏根際酚酸引起的化感效應(yīng),減少根尖活性氧的積累。(1)采用FDA/PI雙染色法,研究8種酚酸混合物對(duì)半夏根系細(xì)胞活力和活性氧積累的規(guī)律,結(jié)果表明:混合酚酸脅迫半夏幼苗隨著時(shí)間的延長(zhǎng)活性氧積累遞增,在4 h后由于積聚大量的活性氧,根細(xì)胞完全凋亡。(2)在含有酚酸類物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的抗氧化劑抗壞血酸(A SC)或龍膽二糖(gentiobiose),測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性,以及ASC-GSH循環(huán)酶中的抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、半脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)的活性,探討外源抗氧化劑對(duì)8種酚酸混合物自毒作用的緩解機(jī)制。結(jié)果表明抗氧化酶SOD在抗壞血酸(ASC)處理36 h和龍膽二糖(gentiobiose)72 h時(shí)活性顯著增強(qiáng),使根系中大量積累的O~(2-)自由基轉(zhuǎn)化為H_2O,從而減少根系活性氧的積累,減輕氧化損傷。外源性抗氧化劑(ASC和龍膽二糖)可能通過(guò)促進(jìn)SOD活性和ASC-GSH循環(huán)酶(APX、DHAR和MDHAR)的增加,幫助根細(xì)胞清除酚酸脅迫導(dǎo)致的過(guò)度積累的ROS。5、重點(diǎn)圍繞半夏連作對(duì)根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化系統(tǒng)研究,以及小麥-半夏輪作對(duì)已變化的群落體系修復(fù)展開分析和討論。本研究利用試驗(yàn)地原始土壤,在溫室環(huán)境下設(shè)計(jì)盆栽實(shí)驗(yàn),并按時(shí)間順序依次獲得連作至輪作盆栽處理組的根際土樣品,各樣品分別代表連作不同時(shí)限根際土、以及輪作不同時(shí)限根際土。用Illumina PE 300平臺(tái)對(duì)土樣進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明,隨著連作時(shí)限的延長(zhǎng),細(xì)菌群落α-多樣性水平呈下降趨勢(shì),連作土經(jīng)輪作后,α-多樣性水平開始升高,且輪作年限延長(zhǎng),多樣性水平越高。表明連作會(huì)導(dǎo)致根際細(xì)菌群落組成趨于簡(jiǎn)單化,而輪作會(huì)使單一化的群落恢復(fù)多樣化構(gòu)成。在屬水平歸類這些OTUs(可操作分類單元)發(fā)現(xiàn)Pseudomonas、Rhizobium、和Streptophyta主要在連作體系中富集,并且連作1年至1年半的根際土中富集的OTUs以St-reptophyta為主,說(shuō)明半夏種植半年(1茬),多數(shù)植物促生長(zhǎng)菌會(huì)被“招募”至根際,但連作1年(2茬)至1年半(3茬),根部病變并開始腐爛,根內(nèi)Streptophyta菌群開始滲入根際。此外,因無(wú)典型病原細(xì)菌OTUs被富集,推測(cè)根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的巨大改變導(dǎo)致病原真菌“趁虛而入”,造成根腐爛�；谶B作1年半土壤,使用小麥輪作半夏,發(fā)現(xiàn)經(jīng)輪作后的根際中被富集的OTUs主要屬于Rhizobium、Pseudomonas、Flavobacteriu m、Sphingomonas、Rhizobacter、和Arthrobacter屬細(xì)菌,說(shuō)明輪作可以使土壤中大量植物促生長(zhǎng)菌回歸半夏根際,促使根際微生物群落恢復(fù)正常�；谏鲜�6類土樣以及原始土間β多樣性,可將所有土樣根據(jù)群落組成特點(diǎn)歸為3類,分別定義為健康土、病害脅迫土、和病害土,并且這三類土間理化特征和群落多樣性具有顯著性差異。使用MET AGENassist數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)這3類土活性微生物組發(fā)現(xiàn),有木聚糖降解、固氮、幾丁質(zhì)降解等功能的細(xì)菌群在3類土壤中的分布存在明顯差異。6、利用Illumina PE 300平臺(tái)對(duì)真菌ITS2區(qū)域進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果表明真菌群群落多樣性隨連作時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。連作土經(jīng)輪作后,真菌群落α-多樣性得到回升,但α-多樣性水平不會(huì)隨輪作時(shí)限的延長(zhǎng)而呈明顯上升趨勢(shì),表明輪作可以適當(dāng)恢復(fù)連作土中真菌群落多樣化結(jié)構(gòu),但無(wú)法通過(guò)延長(zhǎng)輪作時(shí)限來(lái)進(jìn)一步達(dá)到增強(qiáng)群落多樣性的效果。β-多樣性分析表明,連作可使根際土真菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯改變,但變化程度不隨連作時(shí)限的延長(zhǎng)而增強(qiáng);連作1年半的土經(jīng)輪作處理后,真菌群落結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)至連作半年時(shí)群落結(jié)構(gòu)水平。所有土壤經(jīng)聚類分析,發(fā)現(xiàn)原始土、連作土以及輪作土真菌群落結(jié)構(gòu)基本上各自形成一個(gè)聚類群,聚類結(jié)果與連作或輪作時(shí)限無(wú)明顯關(guān)系,說(shuō)明真菌群落結(jié)構(gòu)的形成主要與作物方式高度關(guān)聯(lián)。CAP分析分別建立連作土樣、輪作土樣、以及所有土樣中真菌群落與土壤理化參數(shù)間相關(guān)關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖酶、多酚氧化酶、全鉀等與連作系統(tǒng)中群落結(jié)構(gòu)變化顯著相關(guān);全鉀、有機(jī)碳與輪作系統(tǒng)中群落結(jié)構(gòu)的變化顯著相關(guān);速效氮、全鉀、速效鉀等含量與所有土樣間群落結(jié)構(gòu)差異顯著相關(guān)。使用二項(xiàng)分布的廣義線性模型,分析連作、輪作、對(duì)照組豐度存在顯著性差異的OTUs。結(jié)果表明,連作土?xí)叨雀患瘜儆诓≡婢腛TUs,并且這些OTUs中鐮刀菌屬的OTUs為優(yōu)勢(shì)類群;此外,一些分解纖維素、多糖類的有益真菌OTUs在連作中被抑制。一旦連作土經(jīng)輪作處理后,病原真菌OTUs會(huì)被顯著抑制,有益真菌OTUs豐度會(huì)得到顯著提升。綜上所述,本研究證實(shí)了8種酚酸對(duì)半夏具有化感作用,與小麥輪作后這些酚酸物質(zhì)由根面向根際進(jìn)行了遷移的動(dòng)態(tài)變化,降低了酚酸物質(zhì)對(duì)半夏生長(zhǎng)發(fā)育的危害;在此研究基礎(chǔ)上添加外源抗氧化劑抗壞血酸(ASC)或龍膽二糖(gentiobiose),可顯著緩解連作半夏根際酚酸引起的化感效應(yīng),減少根尖活性氧的積累。本研究還證實(shí)了與小麥輪作可修復(fù)因半夏連作導(dǎo)致的微生物群落結(jié)構(gòu)變化,輪作可以使土壤中大量能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌回歸半夏根際,根際土壤中病原真菌OTUs被顯著抑制,有益真菌O TUs豐度顯著提高。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S567.239
【部分圖文】：

32圖 3-1 a: 半夏對(duì)照土壤樣品總離子流圖 b: 半夏連作根際土壤樣品總離子流圖；(280 nm)re 3-1 a: Total ion current map of Pinellia ternata control soil samples b: Total ion current map of Pinellia ternata continuous cropping rhizosphere soil sa(280 nm)

西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文.3 結(jié)果與分析.3.1 輪作小麥對(duì)半夏根際和根面土壤中總酚酸含量的影響運(yùn)用 Origin 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，探討半夏連作后經(jīng)輪作小麥修復(fù)過(guò)程中土壤總酚積與削減規(guī)律，其變化規(guī)律見圖 4-2。半夏根際和根面土壤中總酚酸的含量總體呈連作年限的增加而升高的趨勢(shì)。半夏連作 2 年、3 年根面土壤以及連作 3 年根際土總酚酸含量最高，相比對(duì)照土壤呈極顯著差異。在輪作體系中，其中輪作 1 年小的根面土壤與連作 3 年半夏的根面土壤中總酚酸含量相比降低了 77.02%，恢復(fù)到水平，差異極顯著，其后的輪作兩年基本趨于一致；輪作 3 年小麥后的根際土壤連作 3 年半夏的根際土壤總酚酸含量相比降低了 55.15%。綜上，半夏連作后經(jīng)輪麥 3 年處理總酚酸顯著減少，輪作根際土壤中總酚含量大于根面土壤，說(shuō)明半夏作過(guò)程中根面土壤中總酚酸往根際土壤遷移。因此，輪作小麥對(duì)于緩解因酚酸引連作障礙具有顯著的效果。

連作—輪作模擬系統(tǒng)中，輪作小麥后鑒定的 8 種單一酚酸在根比例差異非常明顯，如圖 4-3。半夏連作 2 年根面土壤中阿魏酸，其次綠原酸 22.90%、沒(méi)食子酸 14.53%、香草醛 12.27%、香草07%。半夏連作 3 年根面土壤與輪作 1 年根面土壤相比，各酚酸半夏輪作 2 年根面土壤中香草酸所占比例僅 5.44%，丁香酸和丁作 3 年后根面土壤各酚酸含量分別是：沒(méi)食子酸 8.28%、3,4 二原酸 18.27%、丁香酸 10.71%、香草醛 13.64%、丁香醛 0.26%，比例顯著下降，且與對(duì)照相比趨于一致。半夏輪作 1 年根際土相比，原兒茶酸、香草酸、丁香酸均有所降低。連作根際土壤酸>香草醛>丁香酸；輪作根際土壤中：阿魏酸>綠原酸>香草酸>析，半夏連作根際和根面土壤中各酚酸含量均超過(guò)未種植的新壤中的具有抑制作用的酚酸含量總體上低于根際土壤含量。由此低了連作半夏土壤中各酚酸含量，與連作土壤相比，輪作后的 了 50%，并由根面向根際進(jìn)行了動(dòng)態(tài)遷移。各酚酸的變化與輪先降低，然后第 2 年逐漸升高，到第 3 年開始穩(wěn)定。

本文編號(hào)：2830515