煙草(Nicotiana tabacum L.)是重要的葉用型經(jīng)濟(jì)作物,葉片生長(zhǎng)發(fā)育直接影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。山地烤煙種植因立體氣候,海拔較高地區(qū)的煙株易在苗期經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間的低溫,導(dǎo)致煙草早花。早花與花芽的提前分化有關(guān),煙株提前結(jié)束營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),使葉數(shù)、葉片質(zhì)量和品質(zhì)最終達(dá)不到生產(chǎn)上要求。在前期研究中,通過(guò)基因表達(dá)譜篩選和分析,將BR信號(hào)通路與煙草早花緊密的聯(lián)系了起來(lái)。為了研究BR信號(hào)通路與煙草早花的具體聯(lián)系,已用基因編輯技術(shù)得到了BR信號(hào)受體NtBRI1基因的突變體植株B-2,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供材料。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了NtBRI1過(guò)表達(dá)載體,培育出了NtBRI1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株NtBRI1-OE,并對(duì)B-2突變體和NtBRI1-OE轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了不同溫度的處理。通過(guò)對(duì)處理前后農(nóng)藝性狀相關(guān)表型和基因相對(duì)表達(dá)量的觀察、檢測(cè)和分析,所得結(jié)論如下:(1)根據(jù)普通煙草NtBRI1基因CDS序列設(shè)計(jì)引物,成功克隆出了NtBRI1基因序列,測(cè)序后與中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中普通煙草的NtBRI1基因一致性達(dá)到99.8%。利用克隆出的序列成功構(gòu)建了pC2301M1DPB-NtBRI1過(guò)表達(dá)載體,并通過(guò)農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)入植物葉片,組織培養(yǎng)之后經(jīng)過(guò)GUS染色、PCR鑒定和除草劑Basta鑒定等方法得到了NtBRI1-OE轉(zhuǎn)基因植株。(2)將6葉期NtBRI1-OE植株和WT野生型植株進(jìn)行不同溫度處理后,對(duì)相關(guān)性狀、基因表達(dá)量進(jìn)行觀察和檢測(cè),結(jié)果表明:常溫下NtBRI1-OE過(guò)表達(dá)植株現(xiàn)蕾時(shí)間比野生型植株提前了16天,出現(xiàn)了明顯的早花現(xiàn)象,而其與低溫處理的表型差異不大,說(shuō)明植株過(guò)表達(dá)NtBRI1基因后產(chǎn)生了與低溫處理相似的效應(yīng)。基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)也表明NtBRI1基因的過(guò)量表達(dá)最終使轉(zhuǎn)基因植株的NtFLC和NtLFY基因與野生型產(chǎn)生了表達(dá)差異,這可能是導(dǎo)致植株現(xiàn)蕾期提前的關(guān)鍵因素。這說(shuō)明BR信號(hào)通路與煙草的低溫早花現(xiàn)象之間有密切聯(lián)系。(3)對(duì)B-2基因編輯突變體植株進(jìn)行了外源BR噴施實(shí)驗(yàn)。通過(guò)與野生型植株的對(duì)比,發(fā)現(xiàn)B-2突變體植株能夠和野生型一樣對(duì)外源BR作出迅速響應(yīng),使NtBRI1基因相對(duì)表達(dá)量發(fā)生驟增,但突變體植株不能順利的將BR信號(hào)向下傳遞,導(dǎo)致其下游基因NtBSK3的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型植株。這證明B-2突變體中NtBRI1基因功能發(fā)生了缺失,一定程度上阻礙了BR信號(hào)通路中BR信號(hào)向下的傳遞。(4)將6葉期B-2基因編輯突變體植株和WT野生型植株進(jìn)行不同溫度處理后,對(duì)相關(guān)性狀、基因表達(dá)量進(jìn)行觀察和檢測(cè),結(jié)果表明:處理10天結(jié)束后,B-2突變體植株生長(zhǎng)發(fā)育速度突然增快,與野生型植株產(chǎn)生了顯著地差異,這可能與BR對(duì)細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長(zhǎng)的作用之間有密切聯(lián)系,但具體分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究�，F(xiàn)蕾期時(shí),常溫處理下兩個(gè)品種現(xiàn)蕾時(shí)間差別不大,但低溫處理下B-2突變體植株現(xiàn)蕾時(shí)間比野生型植株延遲5天,形成極顯著差異。對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)后,發(fā)現(xiàn)低溫處理下B-2突變體植株與野生型相比,NtFLC基因表達(dá)量較高,而NtLFY基因表達(dá)量較低,這會(huì)對(duì)B-2植株花芽分化產(chǎn)生影響,最終導(dǎo)致花芽分化時(shí)間推遲。這說(shuō)明B-2突變體植株NtBRI1基因功能的缺失導(dǎo)致了其現(xiàn)蕾時(shí)間的延遲,再次說(shuō)明了BR信號(hào)通路與煙草低溫早花之間聯(lián)系密切。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S572
【部分圖文】：

第 1 章 文獻(xiàn)綜述第 1 章 文獻(xiàn)綜述素內(nèi)酯概述素內(nèi)酯簡(jiǎn)介及其生理作用素內(nèi)酯（brassinosteroid，BR）是 種甾醇類植物激素，是繼生素、脫落酸和乙烯之后發(fā)現(xiàn)的第六大植物激素。油菜素內(nèi)酯于 取并純化出來(lái)[1]，它參與調(diào)控多種植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，如細(xì)胞伸期[4]、光形態(tài)建成[5]、抗逆性[6]等。素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑號(hào)在植物體內(nèi)的作用機(jī)理在近年來(lái)被越來(lái)越多的研究，并取得而整個(gè) BRs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也隨著研究的進(jìn)行越來(lái)越清晰，總體過(guò)受體感知、胞內(nèi)信號(hào)傳遞、下游調(diào)控因子激活三個(gè)步驟來(lái)完成

謝如劍等也在研究中指出，煙草品種 G82 在持續(xù) 15d 的 12℃低溫處理后會(huì)引發(fā)植株早花[68]。招啟柏等的研究中也指出，對(duì)煙草成花的促進(jìn)需要 10d 以上的持續(xù)低溫誘導(dǎo)，短時(shí)間的低溫誘導(dǎo)處理對(duì)煙草花芽分化的影響不大[75]。1.4.3 低溫影響植物早花的分子機(jī)制在植物成花轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，CO、FT、FLC 和 SOCI 等基因共同作用，調(diào)控植物開(kāi)花進(jìn)程。研究表明，成花素(Florigen)就是植物葉片中合成的 FT 蛋白，它從葉片中由韌皮部傳送到莖尖，繼而與 FD 蛋白相結(jié)合，使 SOCI 基因的表達(dá)量升高，促進(jìn)植物花芽分化[76]。FLC 是 種開(kāi)花抑制基因，其表達(dá)蛋白通過(guò)與 SVP 蛋白相結(jié)合，從而抑制 FT、SOCI 等基因的合成來(lái)調(diào)控植物開(kāi)花進(jìn)程。在對(duì)擬南芥春化作用的研究中，發(fā)現(xiàn)低溫會(huì)對(duì) FLC 基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，使 FLC 的 mRNA 豐度降低，且隨著低溫處理時(shí)間的增加，F(xiàn)LC 的表達(dá)越弱，最終引起擬南芥早花[77,78,79]。所以，低溫春化作用是 FLC 基因的負(fù)調(diào)控因子，當(dāng)植物受到長(zhǎng)時(shí)間的低溫誘導(dǎo)時(shí)，F(xiàn)LC 基因的表達(dá)量會(huì)大大降低，進(jìn)而與 SVP 蛋白結(jié)合度降低，解除了對(duì) FT、SOCI 等開(kāi)花促進(jìn)基因的抑制，進(jìn)而致使植物早花[80,81,82]。

圖 3.1 NtBRI1 的 PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig. 3.1 PCR amplification band of NtBRI1M： Super DNA maker；圖中的 1、2、3 為擴(kuò)增的 NtBRI1 條帶；M: Super DNA maker; 1, 2 and 3 : Amplified NtBRI1band.表達(dá)載體的構(gòu)建全雙酶切 pEasy-T1- NtBRI1 后，凝膠電泳圖顯示了條帶，因?yàn)?T 載體條帶和目的片段條帶大小相差將兩個(gè)片段同時(shí)回收，在切膠時(shí)應(yīng)盡可能多的切到 T 載體與目的片段重連，對(duì)膠回收產(chǎn)物進(jìn)行了去磷全雙酶切超量表達(dá)載體 pC2301M1DPB 的質(zhì)粒后，。pC2301M1DPB 骨架與 NtBRI1 目的片段連接I1，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α 中，涂至具有卡那液體培養(yǎng)，采用 2 組引物 F35S3N+NtBRI1R、RN

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2828311