研究表明,植物在脅迫條件下經(jīng)歷的刺激記憶能夠跨代遺傳,當(dāng)代受到的脅迫能夠影響有性或無(wú)性后代對(duì)脅迫的反應(yīng)。脅迫記憶現(xiàn)象在植物脅迫機(jī)制研究、抗逆新品種培育等方面具有重要意義。對(duì)于藥用植物,脅迫記憶還能為次生代謝物質(zhì)積累、藥用植物高效栽培和中藥道地性研究方面提供參考。本文中我們以白木香離體根為對(duì)象,創(chuàng)建出具有鹽脅迫記憶效應(yīng)的系列材料,搜索脅迫記憶相關(guān)的標(biāo)志性化學(xué)物質(zhì)和標(biāo)志性基因,為白木香脅迫記憶現(xiàn)象的深入研究奠定基礎(chǔ)。目的:建立白木香離體根的鹽脅迫記憶體系,探究脅迫記憶體系中可溶性糖、抗氧化酶等變化規(guī)律,尋找脅迫記憶體系的標(biāo)志性成分。并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組技術(shù),尋找相應(yīng)標(biāo)志性基因。方法:1.鹽脅迫條件篩選以白木香離體不定根為實(shí)驗(yàn)材料,添加0、150、300、450 m mol/L的鹽脅迫分別處理1、3、5 d,以生根率、側(cè)根生長(zhǎng)情況和脯氨酸含量變化為指標(biāo)篩選鹽脅迫條件,選取對(duì)再生指標(biāo)變化不大且脯氨酸含量變化顯著的鹽脅迫條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.脅迫記憶體系的確立用篩選到的鹽脅迫濃度處理連續(xù)三代白木香離體根,通過(guò)測(cè)定連續(xù)三代鹽脅迫下側(cè)根生長(zhǎng)和脯氨酸含量來(lái)驗(yàn)證該系列材料是否具有“記憶效應(yīng)”。隨后測(cè)定脅迫記憶體系下抗氧化酶活性、可溶性糖含量和化學(xué)成分變化。3.脅迫記憶體系的轉(zhuǎn)錄組分析利用RNA-seq技術(shù),提取總RNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,從轉(zhuǎn)錄組水平分析鹽脅迫記憶體系的差異基因表達(dá)情況,同時(shí)篩選與脯氨酸和可溶性糖含量變化相關(guān)的基因、與植物次生代謝物質(zhì)變化相關(guān)的基因,從中找出鹽脅迫記憶的生物標(biāo)志性基因。結(jié)果:1.鹽脅迫條件篩選白木香離體根經(jīng)0、150、300、450 m mol/L的鹽處理后,次代根的生長(zhǎng)隨鹽處理濃度的增加表現(xiàn)出生根率和側(cè)根條數(shù)降低、側(cè)根直徑增加的趨勢(shì)。其中低濃度下的生根率和側(cè)根條數(shù)與對(duì)照組比較相差不大,且根長(zhǎng)增加,提示低濃度(150 mmol/L)能夠促進(jìn)側(cè)根的生長(zhǎng)。鹽處理后白木香離體根的脯氨酸含量顯著升高。隨著時(shí)間的增加,同一處理濃度下的脯氨酸含量呈先增后降的趨勢(shì),表現(xiàn)出對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)過(guò)程。結(jié)果表明,150 mmol/L處理3 d的鹽脅迫對(duì)白木香離體根的生長(zhǎng)沒有產(chǎn)生較大的抑制效應(yīng)且使脯氨酸含量增高,因此將該濃度作為脅迫記憶實(shí)驗(yàn)濃度。2.脅迫記憶體系的確立用150 mmol/L處理3 d建立鹽脅迫記憶體系,結(jié)果表明該體系下白木香離體根的生根率保持在100%水平,而三代根脯氨酸含量分別為95.37、218.91、1224.77μg/g,即隨處理代數(shù)的增加上升顯著,說(shuō)明連續(xù)脅迫下產(chǎn)生了更快更強(qiáng)的響應(yīng),存在記憶效應(yīng)。我們對(duì)脅迫記憶體系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),可溶性糖的含量變化表現(xiàn)出記憶效應(yīng),即隨鹽脅迫處理代數(shù)的增加而增加。對(duì)比化學(xué)成分發(fā)現(xiàn),脅迫后產(chǎn)生了8種新的化合物,其中N1、N2、N3分別新增7、6、5種化合物。而抗氧化酶含量則無(wú)顯著變化規(guī)律。3.脅迫記憶體系的的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析通過(guò)對(duì)得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,共獲得48286條Unigene,GC百分含量為42.341%,通過(guò)與四大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),共注釋到25575條unigene,注釋率為52.966%。將Unigene與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),注釋結(jié)果顯示,共有5202條unigene注釋到132條KEGG通路中。連續(xù)脅迫三代的白木香離體根中差異基因數(shù)量變化不大,上調(diào)的差異基因數(shù)量減少,下調(diào)差異基因數(shù)量增加。KEGG注釋結(jié)果顯示,顯著變化的通路有42條,我們重點(diǎn)關(guān)注與脯氨酸合成、可溶性糖合成與降解、次生代謝等相關(guān)的變化通路,最終篩選到了與脯氨酸合成相關(guān)的P5CSB、TPRP-F1、SPE2、PIP、ASP1等,與糖類合成和降解相關(guān)的PFK3、At3g03250、SDH等,次生代謝過(guò)程中與黃酮類合成相關(guān)的C12RT1、FLS、CYP98A2、CYP73A11、CHS等,以及與鹽脅迫相關(guān)的PMA4、AVP1等關(guān)鍵基因。我們對(duì)其中部分表達(dá)量高的基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,其變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致,說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可信。同時(shí)分析發(fā)現(xiàn),SPE2、P5CSB基因在脅迫記憶體系中連續(xù)三代的表達(dá)量持續(xù)增加,且與脯氨酸含量表現(xiàn)出顯著正相關(guān),TPRP-F1在連續(xù)三代鹽脅迫中的表達(dá)量與脯氨酸含量呈顯著負(fù)相關(guān),推測(cè)此3種基因可以作為脅迫記憶體系中與脯氨酸含量相關(guān)的分子標(biāo)志基因。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)建立了白木香離體根的鹽脅迫記憶體系,隨后對(duì)脅迫記憶體系中的物質(zhì)變化和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,最終篩選到與脯氨酸合成顯著相關(guān)的3種基因作為其分子水平的標(biāo)志基因。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S567.19
【部分圖文】：

圖 1-1 植物體內(nèi) Glu 到 Pro 的代謝[27]脅迫與藥用植物用植物受鹽脅迫的影響在有效成分方面受到了格外關(guān)注，劉文婷等[28]研銀花葉片中的綠原酸含量變化發(fā)現(xiàn)，隨鹽脅迫時(shí)間的增加，綠原酸含量變化趨勢(shì)。韓立敏等[29]研究鹽脅迫下藥用植物丹參中丹參素含量的變

圖 1-2 轉(zhuǎn)錄組分析流程3.2 藥用植物轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄組學(xué)與傳統(tǒng)的單一基因的研究模式相比，在挖掘功能基因方面具有明顯，可以更為全面、整體、快速地解讀基因信息，信息量更大。通過(guò)對(duì)西洋參、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，可以篩選到很多重要藥效成分物質(zhì)在生物合成過(guò)程中的關(guān)

本實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2807641