【摘要】：朱砂根(Ardisia crenata Sims)是集觀賞、藥用價(jià)值于一身的具有多種生態(tài)及經(jīng)濟(jì)用途的優(yōu)良植物資源,在生態(tài)城市建設(shè)中具有廣闊的應(yīng)用前景,其主要活性成分三萜皂苷(Triterpenoid saponin)有助于心血管疾病和癌癥的防治。本研究首先建立朱砂根愈傷組織培養(yǎng)體系,接著以朱砂根愈傷組織為研究材料、以酵母提取物(Yeast extract,YE)、黑曲霉(Aspergillus niger)、殼聚糖(Chitosan)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)、稀土元素鑭(La)、鈷離子(Co~(2+))等6種誘導(dǎo)子為研究對(duì)象進(jìn)行誘導(dǎo)子的篩選工作,確立促進(jìn)朱砂根愈傷組織三萜皂苷合成的最佳誘導(dǎo)子以及最佳誘導(dǎo)子組合,最后進(jìn)一步分析誘導(dǎo)子對(duì)朱砂根愈傷組織在代謝層面的影響,為探討誘導(dǎo)子調(diào)控三萜皂苷合成的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果不但為朱砂根次生代謝產(chǎn)物三萜皂苷的工廠化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐,而且對(duì)于朱砂根種質(zhì)資源的保存及生態(tài)環(huán)境的保護(hù)也具有重大的理論和實(shí)踐意義。主要研究結(jié)果如下:(1)在比較根、莖、葉3種類型外植體對(duì)朱砂根愈傷組織的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),以莖段為外植體時(shí)誘導(dǎo)率最高,而且愈傷組織的增殖量顯著高于以根和葉為外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織。但是,以莖為外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織的三萜皂苷含量低于以根為外植體的愈傷組織。由此可見(jiàn),以莖段為外植體有利于愈傷組織的生長(zhǎng),以根為外植體有利于三萜皂苷的合成。綜合考慮三萜皂苷產(chǎn)量,以莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織為最優(yōu)處理。(2)在供試濃度中,3種生物誘導(dǎo)子(YE、黑曲霉、殼聚糖)對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)具有不同的生理作用,YE、黑曲霉顯著促進(jìn)生長(zhǎng),殼聚糖抑制生長(zhǎng);而3種生物誘導(dǎo)子對(duì)三萜皂苷合成均表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用,其中以黑曲霉的促進(jìn)作用最強(qiáng)。同時(shí),在對(duì)黑曲霉添加濃度進(jìn)行篩選時(shí),發(fā)現(xiàn)各濃度黑曲霉均能提高朱砂根愈傷組織中三萜皂苷的含量,其中50 mg/L為最佳誘導(dǎo)濃度。但是,黑曲霉促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)的最佳誘導(dǎo)濃度為100 mg/L。因此,綜合考慮三萜皂苷產(chǎn)量,100 mg/L黑曲霉最有利三萜皂苷的生產(chǎn)。(3)在供試濃度中,3種非生物誘導(dǎo)子(MeJA、La、Co~(2+))均有利于朱砂根愈傷組織的生長(zhǎng)以及三萜皂苷的合成,其中以La最能促進(jìn)三萜皂苷的合成。同時(shí),通過(guò)對(duì)La添加濃度的篩選,發(fā)現(xiàn)各濃度下的La均有利于愈傷組織的生長(zhǎng)以及三萜皂苷的合成,其中最佳誘導(dǎo)濃度為30μmol/L。(4)通過(guò)將不同濃度La和黑曲霉進(jìn)行組合的正交試驗(yàn),可以發(fā)現(xiàn)各組合都能促進(jìn)朱砂根愈傷組織三萜皂苷合成。其中,將100 mg/L黑曲霉和30μmol/L La進(jìn)行組合的誘導(dǎo)效果最好,均高于單獨(dú)添加100 mg/L黑曲霉和30μmol/L La。(5)2種誘導(dǎo)子黑曲霉和La以及黑曲霉+La組合可以顯著激活朱砂根愈傷組織抗氧化防御系統(tǒng)和三萜皂苷合成途徑,促進(jìn)三萜皂苷的合成。但誘導(dǎo)效果存在差異性,黑曲霉+La組合誘導(dǎo)效果優(yōu)于2種誘導(dǎo)子單獨(dú)使用(黑曲霉、La)。利用2種誘導(dǎo)子之間的協(xié)同作用,更大程度提高抗氧化酶(SOD、POD、CAT)、三萜皂苷合成關(guān)鍵酶(β-AS)的活性和增加三萜皂苷的積累量。黑曲霉、La作為外源誘導(dǎo)子通過(guò)信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi),迅速刺激朱砂根愈傷組織的氧化應(yīng)激防御系統(tǒng),三萜皂苷合成途徑被活化,促進(jìn)三萜皂苷的合成與積累。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.19
【圖文】：

圖 1-1 三萜皂苷合成途徑Fig. 1-1 Triterpenoid saponins synthesis pathway2.3.1 起始階段在生物體內(nèi)被稱為“活性異戊二烯”的物質(zhì) IPP 和 DMAPP，是萜類化合物和植物甾醇在生物體內(nèi)合成的真正前體[50]。甲羥戊酸（MVA）和甲基赤蘚糖醇磷酸化（MEP）2 條獨(dú)立途徑均可形成 IPP 和 DMAPP[76]�，F(xiàn)有研究表明，MVA和 MEP 途徑分別存在于植物體的不同部位：MVA 途徑主要存在于細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，參與甾醇、倍半萜和三萜等次生代謝產(chǎn)物的生物合成[77]；MEP 途徑主要存在于線粒體/高爾基體以及質(zhì)體中，參與二萜、單萜、類胡蘿卜素、異戊二烯等的生物合成[77]。此外，MVA 途徑和 MEP 途徑并不是相互獨(dú)立的，他們可以通過(guò)質(zhì)體膜交換一些常見(jiàn)的中間代謝產(chǎn)物[78]。MVA 途徑是學(xué)術(shù)界公認(rèn)的三萜皂苷生物合成途徑[79]。這一途徑中不可逆的限速反應(yīng)是 3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶 A（HMG-CoA）經(jīng) HMG-CoA 還原酶（HMGR）還原形成甲羥戊酸[73]。HMGR

中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列不同小寫字母表示在 0.05 水平差異顯著，下同。ata in picture are means±SE. Different lowercase letters mean significant differences at 0.05evel. The same as below.圖 2-1 不同外植體對(duì)三萜皂苷含量的影響Fig. 2-1 Effect of different explants on Triterpenoid saponins content

于新環(huán)境適應(yīng)期，生命活動(dòng)受到抑制。10-25d 為指數(shù)生長(zhǎng)期，愈傷組織細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境開始分裂，數(shù)目迅速增加，鮮重急劇增加，從第 10d 的 2.554g 增 6.2472g，增長(zhǎng)了 144.60%。25d 后，愈傷組織增殖緩慢，進(jìn)入穩(wěn)定期。過(guò)了期之后，愈傷組織將會(huì)進(jìn)入衰退期。因此，我們選擇處于愈傷組織指數(shù)生長(zhǎng)的 25d 作為朱砂根愈傷組織的繼代周期。

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本文編號(hào)：2801356