發(fā)布時間：2020-08-15 10:34

【摘要】：第一部分:花青素是植物三大色素之一,具有吸引昆蟲傳粉,免受病蟲害傷害以及防止紫外線傷害等作用�；ㄇ嗨氐暮铣赏緩皆诟鞣N植物中相對保守,受到結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的雙重調(diào)控:其中結(jié)構(gòu)基因主要是編碼花青素合成途徑中的各種催化酶;而調(diào)節(jié)基因主要是MYB類、bHLH類及WD40類的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控各類結(jié)構(gòu)基因的時空表達。花青素在水稻葉鞘中合成和累積會形成紫色的葉鞘。葉鞘紫色性狀是一個肉眼可辨的性狀,受到質(zhì)量基因控制。我們通過正向遺傳學的方法克隆了調(diào)控水稻葉鞘花青素合成的Rb1和Rb2基因。主要結(jié)果如下:1.利用珍汕97B和西藏2號構(gòu)建的重組自交系群體,我們在第1染色體初定位到一個控制葉鞘紫色的基因,命名為PSH1(Purple Sheath 1)。隨后通過精細定位的方法將PSH1基因定位到143.9 kb的區(qū)間。候選區(qū)間包含19個注釋基因,其中有4個基因注釋為花青素合成的調(diào)節(jié)基因,編碼Lc蛋白。2.通過比較候選基因DNA序列及參考注釋信息,我們確定了Rb2(包含LOC_Os01g39560和LOC_Os01g39580的全長序列)為候選基因。該候選基因在日本晴基因組中全長26.1 kb,在珍汕97B基因組中全長27.5 kb。3.在近等基因系NIL-XZ2中超表達珍汕97B的Rb2等位基因,轉(zhuǎn)基因陽性單株在葉鞘葉片中表現(xiàn)出不同程度的花青素積累,Rb2的基因敲除單株的葉鞘花青素含量明顯減少。但是敲除單株卻不能使葉鞘花青素減少到NIL-XZ2的水平,說明除Rb2外,該區(qū)間可能還存在其它的基因調(diào)控葉鞘花青素的合成。4.用一個Rb2敲除單株和NIL-XZ2的F_2分離群體,我們在Rb2附近定位到另一個控制葉鞘顏色的基因Rb1。表達量分析發(fā)現(xiàn)近等基因系之間Rb1的表達量相差130倍;但Rb1的CDS卻沒有差異,說明Rb1非編碼區(qū)的差異可能導致了它的功能差異。Rb1~(ZS97)在NIL-XZ2中超表達的個體與超表達Rb2~(ZS97)表型基本一致,在葉鞘和葉片中出現(xiàn)不同程度的花青素積累。敲除Rb1~(ZS97)的單株葉鞘顏色也減弱。rb1rb2雙突變材料的葉鞘顏色基本上恢復到NIL-XZ2的水平,說明Rb1和Rb2共同控制葉鞘花青素的合成。5.表達量分析顯示Rb1和Rb2主要調(diào)控花青素合成途徑下游基因F3H、DFR和ANS的表達。超表達植株中花青素的合成和這三個基因的表達量正相關(guān),而敲除單株葉鞘顏色的深淺與這些基因的表達降低相關(guān)。6.異位表達Rb1和Rb2都可以使種皮顏色變紫,類似于“紫稻”。超表達這兩個基因雖然不影響育性,但是降低了種子充實度,飽滿種子約占總數(shù)的10.0%。7.在西藏2號和明恢63組合的F_2群體中,紫色:綠色葉鞘的比例符合9:7的分離比,說明在這個群體里有兩個基因控制葉鞘花青素的合成。經(jīng)過遺傳分析證明這兩個基因是OsC1和Rb1/Rb2(Rb1和Rb2由于緊密連鎖被認為是一個基因)。酵母雙雜交證明Rb1、Rb2與OsC1存在互作。第二部分:在組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的體細胞突變體和自然突變的突變體都屬于自發(fā)突變體,是基因克隆的重要材料。但是這類突變體與野生型基因組序列差別太小,不可能通過與野生型雜交構(gòu)建分離群體的策略來克隆突變基因;此外,大多數(shù)性狀由多基因控制,很難通過與其它品種材料雜交來直接分離突變基因。我們創(chuàng)建了一種快速定位這類突變基因的新方法,主要結(jié)果如下:1.一個來自中花11 T-DNA突變體庫的突變體表現(xiàn)少分蘗和葉色偏黃的表型。T-DNA插入與突變表型不共分離,猜測它可能是組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的體細胞突變體。以EMS誘變產(chǎn)生的無表型變異的中花11(中性突變體)為父本和該突變體雜交。F_2代的葉色分離符合3:1的分離比,說明是單基因突變導致的表型變異。2.我們挑選了30個突變體表型的F_2單株進行DNA混合池測序,經(jīng)過生物信息分析發(fā)現(xiàn)LOC_Os07g04840是該突變基因。突變體在第2外顯子處存在1 bp的缺失,導致蛋白質(zhì)移碼突變。該基因編碼PsbP蛋白。在突變體中超表達野生型中花11的PsbP基因,分蘗數(shù)和葉綠素含量均增加,說明PsbP是控制分蘗數(shù)和葉色的基因。3.我們用一個9311半卷葉自然突變體與EMS誘變的無表型變異的9311(中性突變體)雜交,用相同的方法證實LOC_Os07g01240就是該突變基因,突變體在第3外顯子處存在2 bp的缺失,導致移碼突變。該基因編碼糖磷脂酰肌醇膜錨定蛋白,是一個已報道的控制卷葉的基因。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S511
【圖文】：

也就是花青素的主要存在模式——花青素苷(Houetal2004)（圖1）。圖 1 花青素的化學結(jié)構(gòu) (Hou et al 2004)Figure 1 Chemical structure of anthocyanidins花青素合成途徑屬于類黃酮合成的一個分支途徑，最開始由 3 個丙二酰 CoA(Malonyl-CoA)和一個 4-香豆酰 CoA (p-Coumaroyl-CoA)在查爾酮合成酶(chalconesynthase, CHS)的催化作用下形成花青素的基本骨架查爾酮；隨后在查爾酮異構(gòu)酶

華中農(nóng)業(yè)大學 2019 屆博士研究生學位（畢業(yè)）論文1.3 結(jié)果與分析1.3.1 PSH1 的發(fā)現(xiàn)秈稻品種 ZS97 的葉鞘、稃尖和柱頭均為紫色；而粳稻品種 XZ2 葉鞘整體為綠色，只在基部有輕微的紫色（圖 3A，紅色邊框指示部分），稃尖和柱頭均為紫色，這兩個親本組織的顏色差異主要體現(xiàn)在葉鞘上。

圖 4 RIL 群體遺傳連鎖圖和 PSH1 所在位置Figure 4 The genetic linkage map of the RIL populations and the position of PSH11.3.2 PSH1 的基因克隆1.3.2.1 PSH1 的精細定位由于 F0122600457GA 和 F0123996207GA 兩個 SNP 標記之間相差約 1400 kb（按照 SNP 物理位置相減），區(qū)間較大。并且由于 RIL 群體各基因型已經(jīng)純合，無法通過這種穩(wěn)定群體精細定位并克隆 PSH1，于是我們重新利用 ZS97 和 XZ2 兩親本進行雜交并自交一代得到 F2大群體。ZS97 和 XZ2 的 F1表型介于兩親本之間（圖5 A），表明該基因?qū)儆诓煌耆@性基因，此外親本和雜交種的表型隨著生長時間逐漸加深，約在插秧后第四周表現(xiàn)最為明顯（圖 5B），這也是我們調(diào)查表型所確定的

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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相關(guān)博士學位論文 前3條

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相關(guān)碩士學位論文 前1條

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本文編號：2793992