【摘要】：目的:本研究利用傳統(tǒng)的性狀鑒別和顯微鑒別方法,并結(jié)合DNA條形碼、近紅外光譜、GC-MS三種現(xiàn)代分析技術(shù),對(duì)四種柴胡屬種子進(jìn)行系統(tǒng)鑒別研究,并對(duì)四種柴胡屬種子所含的揮發(fā)油進(jìn)行成分分析。以期為四種柴胡屬種子的準(zhǔn)確鑒別提供科學(xué)依據(jù),為后期的深入研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)對(duì)種子類藥材的快速鑒別提供新的思路。方法:(1)收集北柴胡、南柴胡、三島柴胡、藏柴胡四種柴胡屬種子樣品,觀察種子的性狀特征,并拍照記錄;用掃描電鏡觀察四種柴胡屬種子的種皮表面紋飾特征;用光學(xué)顯微鏡觀察四種柴胡屬種子的橫切片組織結(jié)構(gòu)特征。(2)收集不同地區(qū)的四種共80份柴胡屬種子樣品,采用天根生化科技有限公司提供的植物基因組DNA提取試劑盒提取種子DNA。利用ITS序列對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并從GenBank上下載6個(gè)物種共11條柴胡屬ITS序列,所得產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果經(jīng)CodonCode Aligener9.5軟件進(jìn)行序列拼接,MEGA6.06軟件對(duì)最終序列進(jìn)行分析。比較四種柴胡屬種子的堿基序列長度,種內(nèi)、種間距離以及GC含量的差異,并基于K2P模型構(gòu)建NJ樹,比較四種柴胡屬種子的分支情況。(3)收集四種柴胡種子樣品共80批,在4000-12500cm~(-1)光譜區(qū),采集各種子樣品的NIR光譜,將80批樣品按2:1:1比例隨機(jī)分為訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和測(cè)試集三個(gè)子集。選取特征譜段9000-4100cm~(-1)為建模譜段,分別采用不同光譜預(yù)處理方法進(jìn)行預(yù)處理,并分別進(jìn)行PCA降維。根據(jù)2維主成分平面散點(diǎn)圖,優(yōu)選最佳預(yù)處理方法。利用最佳預(yù)處理方法處理后光譜的PCA降維數(shù)據(jù),建立SVM模式識(shí)別模型,SVM模型參數(shù)采用網(wǎng)格搜索法、遺傳算法(GA)、粒子群優(yōu)化法(PSO)進(jìn)行尋優(yōu)。對(duì)比不同主成分?jǐn)?shù)所建PCA-SVM模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率,確定最佳的主成分?jǐn)?shù),最終建立四種柴胡屬種子的NIR快速鑒別模型。(4)依據(jù)藥典方法提取四種柴胡屬種子的揮發(fā)油,利用GC-MS分析得到其揮發(fā)離子流圖譜,經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜庫(NIST08)進(jìn)行檢索及人工分析,并通過文獻(xiàn)的比對(duì)和CAS號(hào)的查詢確定各個(gè)組分化合物的結(jié)構(gòu)及名稱,應(yīng)用峰面積歸一化法確定各化合物的相對(duì)百分含量,并比較四種柴胡屬種子所含主要化合物的種類和含量的差異。結(jié)果:(1)四種柴胡屬種子在果體顏色、側(cè)棱的顏色、橫切面形狀、合生面寬度、以及種子的長、寬、厚和千粒重上存在差異,但差異較小;掃描電鏡可以觀察到種皮表面紋飾的顯著差別;種子的橫切片組織結(jié)構(gòu)在油管數(shù)、油管形狀和大小等方面都有明顯差異。(2)拼接剪切后柴胡屬種子的堿基長度為529-538bp,種內(nèi)最大遺傳距離小于種間最小遺傳距離,所建柴胡屬種子NJ樹各自聚成一支,與其它種分開。(3)在6500-5400,5000-4100 cm~(-1)建模譜段,確定最佳光譜預(yù)處理方法為二階導(dǎo)數(shù)法(second derivative,SD),SD預(yù)處理光譜PCA降維后,確定最佳主成分前2個(gè)主成分(PC1和PC2)。經(jīng)網(wǎng)格搜索法確定最佳SVM建模參數(shù)組為:c=0.001,g=0.001。所建PCA-SVM模型對(duì)訓(xùn)練集和驗(yàn)證集樣品預(yù)測(cè)正確率均達(dá)100%,模型五折交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率亦達(dá)100%。(4)北柴胡有100個(gè)成分得到鑒定,南柴胡有84個(gè)成分得到鑒定,三島柴胡有78個(gè)成分得到鑒定,藏柴胡有71個(gè)成分得到鑒定。結(jié)論:(1)性狀鑒定與顯微鑒定方法可以對(duì)四種柴胡屬種子進(jìn)行鑒別;(2)ITS序列DNA條形碼對(duì)四種柴胡屬種子具有良好的鑒別能力;(3)所建立的近紅外模型對(duì)四種柴胡屬種子有很好的鑒別精度和預(yù)測(cè)能力,可用于四種柴胡屬種子的快速鑒別;(4)四種柴胡屬種子的揮發(fā)油在所含主要化合物種類和含量上有顯著差異,但GC-MS對(duì)四種柴胡屬種子的鑒別能力有待進(jìn)一步研究探討。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.79;R282.5
【圖文】：

柴胡屬種子性狀圖

柴胡屬種子橫切面圖

柴胡屬種子縱切面圖

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2793172