【摘要】：水稻是世界上最重要的糧食作物之一,其在保存的過程中容易發(fā)生霉變、陳化變質等問題,造成大量的糧食損失。水稻耐儲性問題也成為育種家所面臨的主要挑戰(zhàn)之一。前期研究基礎表明,脂肪氧化酶3(LOX3)是水稻種子脂肪氧化過程中的關鍵酶,LOX3的缺失、反義和干擾表達可提高水稻種子的耐儲藏性,但其具體作用機理尚不清楚。本研究利用實驗室前期構建的差異蛋白表達譜,剖析LOX3代謝途徑,明確LOX3如何與上、下游基因協(xié)調(diào)作用,影響稻谷的耐儲性;同時利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選LOX3的互作蛋白,結合GST pull-down技術對篩選的互作蛋白進行驗證,進而明確水稻種胚LOX3代謝途徑以及LOX3參與調(diào)控稻谷耐儲性的分子機理。主要研究結果如下:1.構建了 pGBKT7-LOX3的酵母雙雜交誘餌載體,自激活實驗結果表明pGBKT7-LOX3不存在自激活現(xiàn)象,將誘餌載體與cDNA文庫雜交,通過四缺培養(yǎng)基篩選得到互作蛋白,構建pGADT7載體進行共轉復篩,最終篩選出了 2個與LOX3可能互作的蛋白質,對應基因分別為:Os02g0758000和Os09g0438700。2.構建了帶有pMAL標簽pMAL-c5X-LOX3原核表達載體,帶有GST 標簽的 pGEX-6P-1-Os0990g38700和pGEX-6P-1-Os02g0758000原核表達載體,轉化BL21菌株,經(jīng)誘導后獲得經(jīng)SDS-PAGE分析,得到 pMAL-LOX3,GST-Os09g0438700和GST-Os09gg0758000融合蛋白。3.通過對種胚LOX3相關代謝通路分析,選擇6個在轉反義LOX3基因水稻種子老化前、后差異顯著蛋白,其對應的基因分別為:Os01g0348600,Os11g0605500,Os06g0204400,Os02g0116500,Os09g0570300,Os02g0676000。通過qRT-PCR技術分析在老化處理前后這些基因表達量的變化情況。結果發(fā)現(xiàn),6個基因在轉基因種子與對照種子老化處理前后的表達量變化差異顯著,與前期蛋白質組學結果一致。
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S511
【圖文】：

用槍頭吹打混勻，從管２吸５＾Ｌ至管３，ｌ0Ｘ，邋１００ｘ，ｌＯＯＯｘ，邋ｌＯＯＯＯｘ稀釋菌液５叫點缺培養(yǎng)基上；逡逑ｉｎ，等菌落完全干燥，置于３０°Ｃ培養(yǎng)３－５ｄ；逡逑酵母ＡＨ１０９中一種半乳糖苷酶ＭＥＬ１的顯，陽性菌落會顯示為藍色，該方法快速簡單，而無需進行復雜的ａ－半乳糖苷酶活性檢測。通否為陽性。逡逑析逡逑因克隆逡逑獲取的基因的ｃＤＮＡ作為模板，用設公司的Ｇｌｅｆｘ高保真酶進行目的基因的擴增，膠電泳分析，（如圖２－１所示）。查閱ＮＣＢＩ網(wǎng)ｐ，圖中所示產(chǎn)物特異性條帶約為２，６００ｂｐ，與Ｍ逡逑ｍ

將ｐＧＢＫＴ７－ＬＯＯ與ＡＤ－ｌｉｂｒａｒｙ共轉到ＡＨ邋１０９酵母菌株中，分別涂布于逡逑ＳＤ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／培養(yǎng)基和ＳＤ／－ａｄｅ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／－ｈｉｓ培養(yǎng)基中，于３０°Ｃ培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)６ｄ，逡逑后觀察菌落長勢，結果如圖２－６所示，結果表明在二缺培養(yǎng)基上長勢較好，而四逡逑缺培養(yǎng)基上菌落數(shù)量明顯減少，但仍有約６０個左右單克隆菌。逡逑圖２－６酵母菌落在缺陷培養(yǎng)基上的生長情況逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－６邋Ｙｅａｓｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｏｎ邋ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑Ａ．ＳＤ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ；Ｂ．ＳＤ／－ａｄｅ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／－ｈｉｓ逡逑挑選多個長勢較好的單克隆菌落，用文庫通用引物Ｔ７／３’ＡＤ進行菌液ＰＣＲ逡逑擴增，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測是否插入片度以及插入片段的大小，ＰＣＲ結果逡逑如圖所示：逡逑２２逡逑

１Ｘ邋１０Ｘ邋１0２Ｘ邋１0３Ｘ邋１0４Ｘ逡逑ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ！逡逑圖２－５誘餌蛋白自激活特性檢驗逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－５邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｕｔｏ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｂａｉｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑２．３．４酵母雙雜交文庫篩選逡逑將ｐＧＢＫＴ７－ＬＯＯ與ＡＤ－ｌｉｂｒａｒｙ共轉到ＡＨ邋１０９酵母菌株中，分別涂布于逡逑ＳＤ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／培養(yǎng)基和ＳＤ／－ａｄｅ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／－ｈｉｓ培養(yǎng)基中，于３０°Ｃ培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)６ｄ，逡逑后觀察菌落長勢，結果如圖２－６所示，結果表明在二缺培養(yǎng)基上長勢較好，而四逡逑缺培養(yǎng)基上菌落數(shù)量明顯減少，但仍有約６０個左右單克隆菌。逡逑圖２－６酵母菌落在缺陷培養(yǎng)基上的生長情況逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－６邋Ｙｅａｓｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｏｎ邋ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑Ａ．ＳＤ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ；Ｂ．ＳＤ／－ａｄｅ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／－ｈｉｓ逡逑挑選多個長勢較好的單克隆菌落，用文庫通用引物Ｔ７／３’ＡＤ進行菌液ＰＣＲ逡逑擴增，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測是否插入片度以及插入片段的大小，ＰＣＲ結果逡逑如圖所示：逡逑２２逡逑

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