發(fā)布時(shí)間：2020-08-02 21:19

【摘要】：水稻是世界上最重要的糧食作物之一,其在保存的過(guò)程中容易發(fā)生霉變、陳化變質(zhì)等問(wèn)題,造成大量的糧食損失。水稻耐儲(chǔ)性問(wèn)題也成為育種家所面臨的主要挑戰(zhàn)之一。前期研究基礎(chǔ)表明,脂肪氧化酶3(LOX3)是水稻種子脂肪氧化過(guò)程中的關(guān)鍵酶,LOX3的缺失、反義和干擾表達(dá)可提高水稻種子的耐儲(chǔ)藏性,但其具體作用機(jī)理尚不清楚。本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的差異蛋白表達(dá)譜,剖析LOX3代謝途徑,明確LOX3如何與上、下游基因協(xié)調(diào)作用,影響稻谷的耐儲(chǔ)性;同時(shí)利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選LOX3的互作蛋白,結(jié)合GST pull-down技術(shù)對(duì)篩選的互作蛋白進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)而明確水稻種胚LOX3代謝途徑以及LOX3參與調(diào)控稻谷耐儲(chǔ)性的分子機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建了 pGBKT7-LOX3的酵母雙雜交誘餌載體,自激活實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pGBKT7-LOX3不存在自激活現(xiàn)象,將誘餌載體與cDNA文庫(kù)雜交,通過(guò)四缺培養(yǎng)基篩選得到互作蛋白,構(gòu)建pGADT7載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)復(fù)篩,最終篩選出了 2個(gè)與LOX3可能互作的蛋白質(zhì),對(duì)應(yīng)基因分別為:Os02g0758000和Os09g0438700。2.構(gòu)建了帶有pMAL標(biāo)簽pMAL-c5X-LOX3原核表達(dá)載體,帶有GST 標(biāo)簽的 pGEX-6P-1-Os0990g38700和pGEX-6P-1-Os02g0758000原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化BL21菌株,經(jīng)誘導(dǎo)后獲得經(jīng)SDS-PAGE分析,得到 pMAL-LOX3,GST-Os09g0438700和GST-Os09gg0758000融合蛋白。3.通過(guò)對(duì)種胚LOX3相關(guān)代謝通路分析,選擇6個(gè)在轉(zhuǎn)反義LOX3基因水稻種子老化前、后差異顯著蛋白,其對(duì)應(yīng)的基因分別為:Os01g0348600,Os11g0605500,Os06g0204400,Os02g0116500,Os09g0570300,Os02g0676000。通過(guò)qRT-PCR技術(shù)分析在老化處理前后這些基因表達(dá)量的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),6個(gè)基因在轉(zhuǎn)基因種子與對(duì)照種子老化處理前后的表達(dá)量變化差異顯著,與前期蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S511
【圖文】：

用槍頭吹打混勻，從管２吸５＾Ｌ至管３，ｌ0Ｘ，邋１００ｘ，ｌＯＯＯｘ，邋ｌＯＯＯＯｘ稀釋菌液５叫點(diǎn)缺培養(yǎng)基上；逡逑ｉｎ，等菌落完全干燥，置于３０°Ｃ培養(yǎng)３－５ｄ；逡逑酵母ＡＨ１０９中一種半乳糖苷酶ＭＥＬ１的顯，陽(yáng)性菌落會(huì)顯示為藍(lán)色，該方法快速簡(jiǎn)單，而無(wú)需進(jìn)行復(fù)雜的ａ－半乳糖苷酶活性檢測(cè)。通否為陽(yáng)性。逡逑析逡逑因克隆逡逑獲取的基因的ｃＤＮＡ作為模板，用設(shè)公司的Ｇｌｅｆｘ高保真酶進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，膠電泳分析，（如圖２－１所示）。查閱ＮＣＢＩ網(wǎng)ｐ，圖中所示產(chǎn)物特異性條帶約為２，６００ｂｐ，與Ｍ逡逑ｍ

將ｐＧＢＫＴ７－ＬＯＯ與ＡＤ－ｌｉｂｒａｒｙ共轉(zhuǎn)到ＡＨ邋１０９酵母菌株中，分別涂布于逡逑ＳＤ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／培養(yǎng)基和ＳＤ／－ａｄｅ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／－ｈｉｓ培養(yǎng)基中，于３０°Ｃ培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)６ｄ，逡逑后觀察菌落長(zhǎng)勢(shì)，結(jié)果如圖２－６所示，結(jié)果表明在二缺培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較好，而四逡逑缺培養(yǎng)基上菌落數(shù)量明顯減少，但仍有約６０個(gè)左右單克隆菌。逡逑圖２－６酵母菌落在缺陷培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－６邋Ｙｅａｓｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｏｎ邋ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑Ａ．ＳＤ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ；Ｂ．ＳＤ／－ａｄｅ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／－ｈｉｓ逡逑挑選多個(gè)長(zhǎng)勢(shì)較好的單克隆菌落，用文庫(kù)通用引物Ｔ７／３’ＡＤ進(jìn)行菌液ＰＣＲ逡逑擴(kuò)增，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否插入片度以及插入片段的大小，ＰＣＲ結(jié)果逡逑如圖所示：逡逑２２逡逑

１Ｘ邋１０Ｘ邋１0２Ｘ邋１0３Ｘ邋１0４Ｘ逡逑ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ！逡逑圖２－５誘餌蛋白自激活特性檢驗(yàn)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－５邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｕｔｏ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｂａｉｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑２．３．４酵母雙雜交文庫(kù)篩選逡逑將ｐＧＢＫＴ７－ＬＯＯ與ＡＤ－ｌｉｂｒａｒｙ共轉(zhuǎn)到ＡＨ邋１０９酵母菌株中，分別涂布于逡逑ＳＤ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／培養(yǎng)基和ＳＤ／－ａｄｅ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／－ｈｉｓ培養(yǎng)基中，于３０°Ｃ培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)６ｄ，逡逑后觀察菌落長(zhǎng)勢(shì)，結(jié)果如圖２－６所示，結(jié)果表明在二缺培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較好，而四逡逑缺培養(yǎng)基上菌落數(shù)量明顯減少，但仍有約６０個(gè)左右單克隆菌。逡逑圖２－６酵母菌落在缺陷培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－６邋Ｙｅａｓｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｏｎ邋ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑Ａ．ＳＤ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ；Ｂ．ＳＤ／－ａｄｅ／－ｌｅｕ／－ｔｒｐ／－ｈｉｓ逡逑挑選多個(gè)長(zhǎng)勢(shì)較好的單克隆菌落，用文庫(kù)通用引物Ｔ７／３’ＡＤ進(jìn)行菌液ＰＣＲ逡逑擴(kuò)增，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否插入片度以及插入片段的大小，ＰＣＲ結(jié)果逡逑如圖所示：逡逑２２逡逑

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本文編號(hào)：2779080