【摘要】：甘藍型油菜(Brassica napus L.)作為重要的油料作物,不僅是食用油與飼料蛋白的主要來源,同時在工業(yè)上的應用也非常廣泛,因此當下亟需提高油菜產量,以滿足日益增長的需求。在農業(yè)生產中,雜種優(yōu)勢因能顯著提高作物產量和改善作物品質被廣泛應用,其中細胞核雄性不育因具有不育性穩(wěn)定徹底、恢復源廣等優(yōu)點,現(xiàn)已成為提高水稻、玉米、油菜等作物產量的重要途徑。前人研究表明,致使雄性不育的過程極其繁雜,具體涉及到雄蕊的形態(tài)建成、花粉囊中各組織分化等多形式、多過程的基因調控,具體的分子機理也尚未明確。本研究通過形態(tài)學觀察和細胞學分析確定D3A花粉敗育的關鍵時期及特點,結合高通量測序技術,對甘藍型油菜顯性核不育純合兩型系不育材料D3A和可育材料D3B進行全基因組重測序和轉錄組測序分析,以期在基因組水平上找到基因突變發(fā)生的位點及在轉錄水平上找到與不育相關的差異基因,為甘藍型油菜顯性核不育材料D3A不育基因的克隆及功能研究奠定基礎,進而豐富我國油菜雜種優(yōu)勢利用的遺傳資源,在加快核不育的定向育種和農藝性狀的快速改良上具有重要意義。主要研究結果如下:1.通過體視鏡對D3A和D3B不同時期花蕾的觀察分析發(fā)現(xiàn),D3A與D3B外觀形態(tài)無明顯差別,均能正常開花,且在雄蕊發(fā)育早期均表現(xiàn)為正常,后期D3A雄蕊退化萎縮,花粉囊不能正常開裂;不育材料D3A子房柱頭發(fā)育的速度明顯快于D3B。通過掃描電鏡對不同時期花藥的觀察發(fā)現(xiàn),D3A花藥的早期基部開始出現(xiàn)皺縮,表皮細胞排列緊密。隨著花蕾的發(fā)育,D3A的花粉囊壁表皮細胞逐漸萎縮,最終塌陷使藥室不能正常開裂釋放花粉;D3B的花粉囊始終呈現(xiàn)出緊致飽滿的狀態(tài),花藥正常開裂,同時釋放出大量成熟花粉粒。最后通過石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn),不育材料D3A和可育材料D3B在花蕾發(fā)育早期,都能形成花粉母細胞,但與D3B相比,D3A中的花粉母細胞結構松散,且絨氈層已開始呈現(xiàn)液泡化狀態(tài);進入四分體時期,不育材料D3A的花粉囊中觀察到高度液泡化的絨氈層細胞,而且無四分體結構出現(xiàn),表明絨氈層細胞已提前發(fā)生降解而未向分泌型轉化,使四分體時期喪失了發(fā)育過程中所必需的營養(yǎng)物質,從而不能形成小孢子并發(fā)育為成熟的花粉粒進行釋放,最終導致不育。因此認為D3A的敗育可能屬于絨氈層發(fā)育異常類型。2.對不育材料D3A和可育材料D3B小花蕾(直徑≤1 mm)和中花蕾(直徑1-2 mm)轉錄組測序分析發(fā)現(xiàn),在D3A的小蕾與中蕾中得到374個差異表達基因,在D3B中得到1458個。在D3A與D3B的小蕾中得到679個差異表達基因,中蕾中得到1423個。結合細胞學分析的結果,獲得90個在小花蕾中特異表達的差異基因,其中上調表達的基因23個,下調表達的基因67個。根據(jù)甘藍型油菜基因組注釋信息,這些基因的功能主要是參與催化活性與蛋白結合,其中包括1個與花粉母細胞減數(shù)分裂相關的基因,5個轉錄因子等。通過差異基因的GO功能注釋和KEGG Pathway富集分析發(fā)現(xiàn),共獲得135個顯著的GO terms和9個顯著富集的Pathway,在顯著富集的9條代謝通路中,Wnt信號通路、TGF-β信號通路與mRNA監(jiān)測通路與育性顯著關聯(lián)。另外,基因BnaC02g17290D和BnaC05g01600D分別與Wnt信號通路及mRNA監(jiān)測通路相關聯(lián),因此認為上述兩個基因可能為調控育性的重要差異候選基因。3.對不育材料D3A和可育材料D3B進行全基因組重測序比較分析,在D3A和D3B中分別檢測到2176589個和2163868個SNP變異位點,448107個和444533個InDel變異位點,118415個和117250個SV變異位點,37005個和36146個CNV變異位點。在A亞基因組各染色體上SNP及InDel變異位點呈均勻連續(xù)分布,而C亞基因組上各變異位點呈現(xiàn)不均勻分布,在C02、C03、C05、C07及C09等染色體中尤為顯著,且在C05染色體上的連續(xù)未變異區(qū)域約占50%。在SNP變異中,轉換變異數(shù)多于顛換變異數(shù),且在D3A中的變異數(shù)略高于D3B。在InDel變異中,片段插入量略高于片段缺失,且D3A中發(fā)生插入變異的位點多于D3B。在SV變異中,發(fā)生染色體重排的變異位點數(shù)遠遠高于其他變異類型,且不育材料D3A中的重排數(shù)略高于可育材料D3B。CNV變異中,拷貝數(shù)缺失的發(fā)生遠高于拷貝數(shù)重復,且D3A中的拷貝數(shù)缺失明顯多于D3B,拷貝數(shù)的缺失可能影響到基因編碼區(qū)或縮短開放讀碼框。上述四種變異可能改變附近基因的表達水平,從而在D3A與D3B中出現(xiàn)差異表達并引起不同的表型變異。提取D3A及D3B中的有義變異位點信息進行比較分析,為后期篩選育性相關分子標記提供數(shù)據(jù)參考。4.與擬南芥基因表達譜數(shù)據(jù)庫進行比對,并整合全基因組重測序與轉錄組測序結果,共得到10個在外顯子區(qū)域發(fā)生變異的差異表達基因,它們主要參與蛋白質合成過程。qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)結果表明,發(fā)生變異的10個差異表達基因中除了基因BnaA09g16280D外,余下9個基因在D3A與D3B中表達量均存在差異,因此本研究將這9個基因作為可能引起不育的候選基因。其中8個基因在不育材料D3A小花蕾中顯著下調表達,這與轉錄組分析結果一致;但基因BnaA03g44650D的表達量在D3A小花蕾中高于D3B,這種情況可能因為與qRT-PCR相比較,轉錄組在檢測低豐度轉錄物及基因表達變化方面更靈敏。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S565.4
【圖文】：

1993)及其衍生系896AB(董振生等, 1998, 1999; 王武萍等, 1992)，白菜中發(fā)現(xiàn)的ABl58、91-5A(張書芳等, 1990, 1994)等都屬于此種類型。圖1-1 雙基因互作顯性細胞核雄性不育“三系法”制種示意圖(劉川, 2014)Fig1-1 Genetic model of hybrid seed production for digenic male sterility using ‘threelines’method

錄組測序技術的流程(Wang et al., 2009)中，首先是提取樣本的總測 RNA 種類進行分離純化，然后將細胞中的所有轉錄產物文庫，將 cDNA 文庫中的 DNA 隨機剪切為小片段，進而片段化所需的長度（或反轉錄后片段化），然后在 cDNA 兩端加上接高通量測序儀進行雙末端測序，直到獲得測序平臺所需的序列，對(有參考基因組)或從頭組裝(無參考基因組)形成全基因組范圍程中所用到的雙末端測序是目前各平臺廣泛采用的一種策略，該 DNA 或 cDNA 打斷為一定長度的片斷后從兩端進行測序，這樣獲得距離已知的兩條序列信息，同時相對于單端測序增加了物cal Coverage)(Ozsolak et al., 2011; Maher et al., 2009)，因此顯著增的能力。在轉錄組測序中，雙末端測序使信號可以更好地與轉錄如，可以更好地區(qū)別不同剪切方式(Au et al., 2010)，鑒定由染色合基因(Maher et al., 2009; Edgren et al., 2011)等。具體測序流程如

圖 2-1 兩型系 D3A和 D3B花發(fā)育的形態(tài)分析Fig. 2-1 Morphological analysis of flower development in D3A and D3B: D3A花蕾; B: D3B 花蕾; C: D3A剝去花瓣的花蕾;D: D3B 剝去花瓣的花蕾; E: D3A花; F: D3B 花 1 mm: buds of D3A; B: buds of D3B; C: buds without petals of D3A; D: buds without petals of D3B; E: flow; F: flowers of D3B. Bar = 1 mm 純合兩型系 D3A 和 D3B 雄蕊掃描電鏡觀察掃描電鏡觀察甘藍型油菜顯性純合兩型系 D3A 和 D3B 不同發(fā)育時期的，D3A 花藥的早期基部開始出現(xiàn)皺縮，表皮細胞排列緊密，D3B 的花育（圖 2-2A, D）。隨著花蕾的不斷伸長生長，D3A 的花粉囊壁表皮細縮，花粉囊出現(xiàn)塌陷，花藥縱徑無明顯變化，而 D3B 的花粉囊壁表皮現(xiàn)正常，花粉囊持續(xù)變大，花藥縱徑也明顯伸長（圖 2-2B, E）。直到開放，整個發(fā)育過程中不育材料 D3A 的花粉囊逐漸干癟萎縮，花藥縱明顯變化，花粉囊繼續(xù)萎蔫塌陷，藥室不能正常開裂釋放花粉；可育

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 楊海嬌;張德強;;植物基因組拷貝數(shù)變異研究現(xiàn)狀[J];分子植物育種;2015年08期

2 陳勇;柳亦松;曾建國;;植物基因組測序的研究進展[J];生命科學研究;2014年01期

3 楊莉芳;刁現(xiàn)民;;植物細胞核雄性不育基因研究進展[J];植物遺傳資源學報;2013年06期

4 劉紅亮;鄭麗明;劉青青;權富生;張涌;;非模式生物轉錄組研究[J];遺傳;2013年08期

5 張春蘭;秦孜娟;王桂芝;紀志賓;王建民;;轉錄組與RNA-Seq技術[J];生物技術通報;2012年12期

6 岳桂東;高強;羅龍海;王軍一;許姣卉;尹燁;;高通量測序技術在動植物研究領域中的應用[J];中國科學:生命科學;2012年02期

7 伍林濤;杜才富;周凌;張敏琴;曾章麗;陳琨;韓宏仕;;油菜顯性核不育系統(tǒng)的研究與利用[J];生物技術世界;2012年02期

8 祁云霞;劉永斌;榮威恒;;轉錄組研究新技術:RNA-Seq及其應用[J];遺傳;2011年11期

9 井趙斌;魏琳;俞靚;程積民;;轉錄組測序及其在牧草基因資源發(fā)掘中的應用前景[J];草業(yè)科學;2011年07期

10 吳瓊;孫超;陳士林;羅紅梅;李瀅;孫永珍;牛云云;;轉錄組學在藥用植物研究中的應用[J];世界科學技術(中醫(yī)藥現(xiàn)代化);2010年03期

相關博士學位論文 前2條

1 曾芳琴;油菜S45AB隱性核不育分子機理與應用研究[D];華中農業(yè)大學;2010年

2 洪登峰;甘藍型油菜顯性細胞核雄性不育基因Ms/Mf的定位[D];華中農業(yè)大學;2006年

相關碩士學位論文 前7條

1 王蒙召;基因組重測序基礎上的早實枳與普通枳部分差異基因比較分析[D];華中農業(yè)大學;2016年

2 徐明月;甘藍型油菜發(fā)芽期耐漬相關基因的篩選[D];中國農業(yè)科學院;2014年

3 劉川;甘藍型油菜隱性純合兩型系的形態(tài)學及轉錄組學分析[D];西南大學;2014年

4 夏秀云;甘藍型油菜雄性不育相關基因BnATA20功能驗證[D];華中農業(yè)大學;2011年

5 韓雪;甘藍型油菜顯性細胞核雄性不育系雌性不孕的細胞學研究[D];華中農業(yè)大學;2010年

6 李勇;甘藍型油菜顯性核不育雄配子發(fā)育相關基因Bnrad23的克隆及初步分析[D];華中農業(yè)大學;2008年

7 王道杰;油菜單顯性核不育基因的分子標記及其輔助選擇研究[D];西北農林科技大學;2003年

本文編號：2772774