【摘要】：丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)又稱紅根、大紅袍等,是草本植物,屬于雙子葉植物唇形科鼠尾草屬。于《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》等均有記載,主要治療婦科病,具有活血化瘀、調(diào)經(jīng)等功效,此外對神經(jīng)性衰弱失眠、冠心病、關(guān)節(jié)痛等均有療效。丹參的有效藥用成分有親水性的酚酸類物質(zhì)和親脂性的丹參酮類物質(zhì),其中酚酸類物質(zhì)包括迷迭香酸(Rosmarinicacid,RA)、丹酚酸B(Salvianolic acid B,SalB)和阿魏酸等。丹參酮類物質(zhì)包括丹參酮I(Tanshinone I)、丹參酮IIA(Tanshinone IIA)、二氫丹參酮I(Dihydrotanshinone I)、隱丹參酮(Cryptotanshinone)等。近幾年來,丹參次生代謝途徑受到越來越多的關(guān)注,本研究以丹參毛狀根為模式材料,通過轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)錄組及代謝組聯(lián)合分析,嘗試探討丹參SmMYB36基因?qū)祁惡捅奖榇x途徑調(diào)控的機(jī)制。1.對SmMYB36進(jìn)行截短并構(gòu)建到酵母表達(dá)載體,得到pDEST-GADT7-SmMYB36、pDEST-GADT7-SmMYB36~(1-111),pDEST-GADT7-SmMYB36~(112-160),pDEST-GADT7-Sm MYB36~(112-160)。酵母雙雜交驗證發(fā)現(xiàn)SmMYB36全長和C端具有自激活活性,N端不具有自激活活性。2.克隆IIId、IIIe和IIIf家族的SmbHLH基因,將克隆成功的SmbHLH構(gòu)建到酵母表達(dá)載體上,得到pDEST-GADT7-SmbHLH128、pDEST-GADT7-SmbHLH31、pDEST-GADT7-SmbHLH37、pDEST-GADT7-SmbHLH43、pDEST-GADT7-SmbHLH53、pDEST-GBKT7-SmbHLH51和pDEST-GADT7-SmbHLH6,通過酵母雙雜交,驗證得到SmbHLH128和SmMYB36發(fā)生互作。3.構(gòu)建過表達(dá)載體pGWB18-SmMYB36和顯性抑制載體pK7WG2R-SRDX-SmMYB36,并誘導(dǎo)得到過表達(dá)和顯性抑制轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根。使用高效液相(High performance li-quid chromatography,HPLC)分析轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根次生代謝物含量,發(fā)現(xiàn)pGWB18-SmMYB36過表達(dá)丹參穩(wěn)定的提高了丹參酮類物質(zhì):隱丹參酮、丹參酮II A、丹參酮I和二氫丹參酮;而降低了酚酸類物質(zhì):迷迭香酸和丹酚酸B。pK7WG2R-SRDX-SmMYB36檢測結(jié)果與過表達(dá)丹參毛狀根相反。4.熒光定量PCR分析轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根次生代謝通路上關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量。過表達(dá)丹參毛狀根丹參酮合成途徑中,過表達(dá)材料的SmCPS1、SmCYP76AH1和SmKSL1的表達(dá)量較野生型和空載都有明顯升高;酚酸合成途徑中,過表達(dá)材料的SmPAL1表達(dá)量較野生型和空載有明顯的下降,SmRAS1和SmCYP98A41表達(dá)量沒有明顯的變化。反之,顯性抑制材料的SmCYP76AH1、SmKSL1和SmCPS1表達(dá)量較野生型和空載的材料沒有明顯變化,SmPAL1和SmRAS1的表達(dá)量較野生型和空載有明顯的升高,但是SmCYP98A41的表達(dá)量沒有明顯的變化。5.對pGWB18-SmMYB36過表達(dá)轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,初生代謝中SmGAPDH、SmGPI、SmPEPCK和SmCS表達(dá)量降低,SmMDH表達(dá)量升高;次生代謝中SmGGPPS、SmTAT1和SmPAL3表達(dá)量升高,SmDXS2、Sm4CL2和SmHPPR2表達(dá)量降低。代謝組分析得到初生代謝產(chǎn)物無水葡萄糖、果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸。莽草酸和奎寧酸含量升高,琥珀酸、景天庚酮糖-7-磷酸和核糖-5-磷酸降低,次生代謝中二氫丹參酮I和隱丹參酮含量升高,迷迭香酸、丹酚酸C和阿魏酸降低。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.53
【圖文】：

丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)又稱紅根、大紅袍等，是草本植物，屬于多年生葉植物唇形科鼠尾草屬，生長于中國北方、韓國和日本等地（Yang et al. 2013；Wenp et al. 2011)）。丹參干燥的根呈細(xì)長狀，有分支，磚紅色，可以入藥，《神農(nóng)本草經(jīng)本草綱目》等均有記載，主要治療婦科病，具有活血化瘀、調(diào)經(jīng)等功效，對血瘀的婦女痛經(jīng)、閉經(jīng)具有良好的療效，此外對缺血性心血管病、神經(jīng)性衰弱失眠、病、關(guān)節(jié)痛等均有療效(陳凌霆等 2018; 陳文娟 2016)。丹參的有效藥用成分有親的酚酸類物質(zhì)和親脂性的丹參酮類物質(zhì)，其中酚酸類物質(zhì)包括迷迭香Rosmarinicacid，RA）、丹酚酸 B（Salvianolic B, SalB）、咖啡酸（Caffeic acid）、丹（Danshensu）、紫草酸（Lithospermic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、原兒茶3,4-Dihydroxybenzaldehyde）、肉桂酸（Cinnamic acid）、對香豆酸（p-Hydroxycinnamcid）和丹酚酸 A（Salvianolic acid A, SalA）等，其中主要藥性成分是丹酚酸 B 和迷酸。丹參酮類物質(zhì)包括丹參酮 I（Tanshinone I）、丹參酮 II A（Tanshinone IIA）、丹參酮 I（Dihydrotanshinone I）、隱丹參酮（Cryptotanshinone）、異隱丹參Isocryptotanshi-none）、丹參酮 IIB（Tanshinone IIB），其分子結(jié)構(gòu)的共同特點是均鄰琨或?qū)︾慕Y(jié)構(gòu)(代曉光和蘇長蘭 2018; 宋經(jīng)元等 2013; 王涵等 2018)。

圖 1-2 幾種丹參酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)（張順倉 2014）.1-2 Chemical structures of some of tanshinones in S. miltiorrhiza（Zhang Shuncang 2參中親水性的酚酸類物質(zhì)合成途徑目前已經(jīng)研究的較為透徹，糖酵解（Gy，GP）途徑生成 4-磷酸-赤蘚糖，戊糖磷酸途徑（Pentose phosphate pa生成磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate, PEP），通過醛醇縮合反應(yīng)（Phenethyl alcohol, DAPH），進(jìn)入莽草酸循環(huán)（Shikimate pathway），發(fā)應(yīng)生成 3-脫氫奎寧酸，一系列反應(yīng)后生成分支酸，通過預(yù)苯酸生成途徑(L-Tyrosine)和 L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine)，其中 L-酪氨酸通過酪氨酸氨酶（Tyrosine-α-ketoglutarate aminotransferase, TAT）生成了 4-羥苯基ydroxyphenylpyruvate, 4-HPPA ）， 再 通 過 羥 基 苯 丙 酮 酸 還 原 酶 (phenylketate reductase, HPPR)的作用生成了 4-羥基苯乳酸（4-Hydroxyphe4-HPLA）(Hou X et al. 2013; Huang B et al. 2008; W C et al. 2008; Xiao苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶的作用下生成了肉桂酸（T-Cinnamic acid），桂酸-4-羥化酶（Cinnamic acid-4-hydroxylase, C4H）作用生成了 4

圖 2-1 電泳檢測 PCR 產(chǎn)物er, 1: 克隆得到的 SmMYB361-111片段產(chǎn)物 (B) M: DL2000 ma段產(chǎn)物 (C) M: DL2000 marker, 3: 克隆得到的SmMYB36112-1DL2000 marker, 4: 克隆得到的 SmMYB361-153片段產(chǎn)物Fig. 2-1 Electrophoresis of PCR productsrker, 1: cloned SmMYB361-111fragment products (B) M: DL2000 mment products (C) M: DL2000 marker, 3: cloned SmMYB36112-153) M: DL2000 marker, 4: cloned SmMYB361-153fragment products 截斷片段通過 Gatway 構(gòu)建到表達(dá)載體 pDEST-GBKT菌感受態(tài)細(xì)胞中，對單克隆進(jìn)行菌液 PCR 鑒定，鑒KT7-SmMYB36 大小約 500 bp，pDEST-GBKT7-SmM， pDEST-GBKT7-SmMYB36112-160大 小 約 mMYB361-153大小約500 bp和pDEST-GBKT7-SmMYB，將重組載體質(zhì)粒送公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與預(yù)期

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本文編號：2743867