【摘要】：土壤有效磷缺乏嚴重影響了作物的生長發(fā)育,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要通過施用磷肥增加土壤有效磷,但即將枯竭的磷礦資源迫使我們從植物自身提高磷吸收利用效率。為探索苜蓿磷高效吸收利用相應的策略及調(diào)控通路,本研究將以紫花苜蓿為材料,分析耐低磷較強的耐鹽之星品種低磷生理與形態(tài)響應,以及運用組學技術(shù)、生物信息學和分子生物學等手段從miRNA水平深入研究紫花苜蓿低磷應激機制。本研究包括3部分試驗:(1)耐低磷紫花苜蓿品種的篩選:利用隸屬函數(shù)方法綜合評價25個國內(nèi)外紫花苜蓿品種的耐低磷性;(2)苜蓿對低磷脅迫的生理與形態(tài)響應分析:分別檢測常磷(0.5 mmol/L KH_2PO_4)與低磷(5μmol/L KH_2PO_4)下紫花苜蓿生理與形態(tài)變化;(3)低磷應激miRNAs的鑒定及功能分析:利用Illumina 2500高通量測序平臺分析常磷和低磷條件下差異表達的miRNAs,并分析靶基因功能以及可能參與的調(diào)控通路。主要得到以下結(jié)果與結(jié)論:1.檢測了低磷處理30 d紫花苜蓿的莖葉干重、株高、根干重、根冠比、總根長、根表面積、全磷含量、磷利用率以及酸性磷酸酶活性,進一步利用主成分分析濃縮為3個新的相互獨立的綜合指標,評價結(jié)果顯示敖漢、皇冠、耐鹽之星等的耐低磷性較強。2.低磷脅迫下,耐低磷較強的苜蓿(耐鹽之星)地上部分和地下部分生長都受到抑制,但根冠比顯著增加(P0.05);根組織中的酸性磷酸酶活性增強,低磷脅迫20 d時根中的檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸分別是對照的4.14、2.67、2.09倍;綜合表明,紫花苜�？赡芡ㄟ^增加根冠比、提高酸性磷酸酶活性以及分泌有機酸應對低磷環(huán)境。3.分別構(gòu)建了耐鹽之星常磷根(NPR)、低磷根(LPR)、常磷莖葉(NPS)和低磷莖葉(LPS)小RNA文庫,每個文庫3個生物學重復,高通量測序共鑒定到264個已知miRNAs和157個新miRNAs,根和莖葉中分別檢測到47個和44個差異表達的miRNAs,其中包括低磷誘導上調(diào)的miR399、miR398、miR5287等,和低磷誘導下調(diào)的miR156、miR160、miR169、miR171、miR2643、miR396等。4.利用psRNATarget、TargetFinder和Tapirhybrid軟件綜合預測到909個差異表達的miRNA靶基因,主要包括參與生長發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子(MYB、AP2、GRAS、CCAAT和MADS等)和生長調(diào)節(jié)因子,參與根發(fā)育的生長素應答因子,多種抗逆保護蛋白以及磷轉(zhuǎn)運蛋白等。RLM-RACE結(jié)果證明miR156、miR160a、miR160c、miR166和miR396作用的靶基因位點與預測結(jié)果一致。靶基因GO和KEGG富集結(jié)果主要包括信號傳導,糖類、脂肪、氨基酸基本代謝過程,激素刺激響應、化學刺激響應和生長素調(diào)控通路等。根據(jù)苜蓿在低磷下生理與形態(tài)的響應和差異表達的miRNAs及靶基因,miRNAs主要參與的苜蓿低磷應激調(diào)控有:(1)氨基酸、糖類、脂肪酸等基礎代謝響應;(2)具有普遍抗逆保護蛋白形成的應激響應;(3)根系的生長發(fā)育;(4)磷轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)控和有機酸的分泌等低磷特異響應。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S541.9
【圖文】：

對于有效磷密度而言，東部沿海地區(qū)和青藏高原地區(qū)要低于其他地區(qū)（汪濤等，2008）（圖1.1）。圖 1.1 中國土壤有效磷密度分布圖（汪濤等，2008）Fig. 1.1 Spatial pattern of available phosphorus density in China植物主要以 HPO42-和 H2PO4-的形式從土壤中獲取磷素，施入土壤的磷肥中的磷與某些金屬離子及土壤黏粒通過吸附固定、沉淀或微生物吸收作用形成鐵磷、鋁磷、錳磷、鈣磷和鎂磷等難溶性鹽，而 PO43-不易被吸收植物根系吸收利用，使土壤成為無效的“天然磷庫”，在降水和灌溉作

圖 1.2 植物適應較低土壤有效磷策略注：低磷脅迫下植物通過根分泌有機酸、磷酸酶提高土壤有效磷，以及結(jié)合叢枝菌根真菌輔助磷的吸收，根系的生長發(fā)育受基因、糖和激素的調(diào)控。Fig. 1.2 Plant strategies to enhance phosphate (Pi) availability in the soilNote: The production and secretion of organic acids (OAs) and phosphatases as well as the arbuscular mycorrhizal (AM)associations with the root system of bean, for example, enhance Pi availability in the soil and P uptake by roots. Inaddition, the development of a highly branched root system, controlled by several genes, sugar, and hormones, enhancesthese root traits (Lopez-Arredondo et al., 2014).1.1.1 根系結(jié)構(gòu)對低磷的適應機制植物主要通過向地性變化和根冠之間的能量分配來改變根構(gòu)型，低磷環(huán)境下，建立較為理想的根構(gòu)型是確保在消耗較少碳源的前提下吸收磷的重要手段（Lynch, 2011; Lopez-Arredondo et al.,2014），如菜豆“深根吸水，淺根吸磷”的傘狀根構(gòu)型是磷吸收的理想根構(gòu)型（廖紅和嚴小龍，2000）。目前已經(jīng)對多種植物包括擬南芥、玉米、水稻、馬鈴薯和菜豆在低磷脅迫下根系構(gòu)型進行了解剖，表現(xiàn)為低磷促進側(cè)根原基的分化、主根及側(cè)根的生長、側(cè)根角度的調(diào)整以及調(diào)整根毛的密度和延伸（Lopez-Bucio et al., 2002; Lopez-Bucio et al., 2003）。研究發(fā)現(xiàn)根構(gòu)型變化受激素（生

中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 引言DEGRADING NUCLEASE (SDN)降解，由于 HENI 的甲基化作用對 dsRNA 具有偏好性，暗示HEN1對于miRNA的甲基化是發(fā)生在miRNA和miRNA*雙鏈分離之前（趙猛，2014；Yu et al., 2005;Yang et al., 2006b）（圖 1.4-A）。植物 pre-miRNA 或成熟的 miRNA由DCL1 加工并由HASTY（HST）（一種與 exportin 5（EXP5）同源的輸出蛋白）轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)，一般 pre-miRNA 在植物體內(nèi)出現(xiàn)的時間特別短，可能是 HST 很快地將 miRNA/miRNA*或單鏈 miRNA 運出，大家也普遍認為最終的 miRNA 成熟也發(fā)生于細胞質(zhì)（Ha and Kim, 2014）（圖 1.4-B）。在細胞質(zhì)中，miRNA 被裝載到細胞質(zhì) ARGONAUTE（AGO）蛋白上，其中 AGO1 是 miRNA途徑的主要參與者（Jones-Rhoades et al., 2006; Chen, 2009; Voinnet, 2009; Ha and Tran, 2014）。另一方面，miRNA 裝載到沉默復合體可保護其免受降解，而 miRNA*被降解掉（Jones-Rhoades et al.,2006）。其中 miRNA 結(jié)合到誘導的基因沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC），形成非對稱 RISC 復合物，進一步引導沉默復合體（RISC）降解 mRNA 或阻礙其翻譯。非對稱 RISC裝載源于 siRNA 5′末端的穩(wěn)定性，5′末端穩(wěn)定性差的 siRNA 則會被裝載到 RISC 復合體，例如miRNA5′末端穩(wěn)定性要差于相對應的 miRNA*的穩(wěn)定性（Schwarz et al., 2003）（圖 1.4-C）。

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本文編號：2743210