發(fā)布時間：2020-06-14 20:56

【摘要】：植物中的類鈣調(diào)神經(jīng)素B亞基蛋白CBL(Calcineurin B-like protein)家族成員與其互作蛋白激酶CIPK(CBL-interacting kinase protein)家族成員形成了復(fù)雜精細(xì)的CBL-CIPK信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò),在解碼生物和非生物脅迫激發(fā)的鈣信號及信號的進(jìn)一步傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。CBL家族成員CBL10參與植物抵抗高鹽脅迫、應(yīng)對病菌侵染、參與分生組織和花器官發(fā)育、調(diào)節(jié)離子平衡等多個過程,對其下游互作CIPK家族成員的篩選與鑒定對于明確上述調(diào)節(jié)機(jī)制至關(guān)重要。為了鑒定林煙草(Nicotiana sylvestris)NsylCBL10下游互作NsylCIPK家族成員,本研究首先以擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtCIPK家族成員和水稻(Oryza sativa)OsCIPK家族成員基因的CDS序列為檢索序列,利用NCBI和中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫對林煙草中可能存在的NsylCIPK家族成員進(jìn)行了預(yù)測;然后通過RT-PCR方法對預(yù)測到的NsylCIPK家族成員進(jìn)行了克隆并利用生物學(xué)分析軟件對其基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析;最后通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)鑒定了與NsylCBL10互作的NsylCIPK家族成員。結(jié)果表明,在林煙草中可能存在28個NsylCIPK家族成員,實(shí)際克隆獲得了20個NsylCIPK家族成員,在酵母雙雜交體系中與NsylCBL10互作的只有1個NsylCIPK家族成員NsylCIPK14a。通過PCR以及抗生素抗性篩選鑒定突變體,成功拿到NsylCBL2轉(zhuǎn)煙草突變體、NsylCBL2轉(zhuǎn)擬南芥突變體、擬南芥atcbl3突變體和擬南芥atcbl2atcbl3雙突變體。對這些突變體進(jìn)行了種子發(fā)育和離子抗性的分析,結(jié)果表明NsylCBL2轉(zhuǎn)擬南芥和轉(zhuǎn)煙草的突變體沒有表現(xiàn)出和對照之間的明顯的差異。本研究為解析林煙草及其他物種中CBL-CIPK信號通路的調(diào)節(jié)功能提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S572
【圖文】：

18圖 2.1 NsylCIPK 家族成員鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹分析Figure 2.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of CIPK family members2.3.2 NsylCIPK 家族成員的克隆及結(jié)構(gòu)分析根據(jù)預(yù)測的 28 個 NsylCIPK 家族成員的 CDS 序列設(shè)計(jì)引物，以林煙草 cDNA 為模板，克隆得到了其中的 20 個成員。由于擬南芥 AtCIPK 家族成員的功能研究更為深入，為了方便后續(xù)分析和研究，根據(jù)與 AtCIPK 家族成員在進(jìn)化樹中親源關(guān)系的遠(yuǎn)近對克隆獲得的 NsylCIPK 家族成員進(jìn)行命名(表 2.9)。對克隆獲得的 20 個 NsylCIPK 家族成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖 2.2)，結(jié)果表明，該家族成員可以根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分為兩類：第一類包括亞家族 Subgroup1、Subgroup2、Subgroup3 和 Subgroup4中的成員，都具有少內(nèi)含子特征，僅含有 1~2 個外顯子；第二類包括 Subgroup5 中的成員，具有多內(nèi)含子特征，含有 12~15 個外顯子。從進(jìn)化關(guān)系上來看，少內(nèi)含子成員位于進(jìn)化樹的基部，表明進(jìn)化初期 NsylCIPK 家族成員含內(nèi)含子較少，后來逐漸進(jìn)化出多內(nèi)含子成員。

圖 2.2 獲得的 NsylCIPK 家族成員的進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)分析Figure 2.2 Phylogenetic analysis and gene structures of cloned NsylCIPK genes對克隆獲得的 20 個 NsylCIPK 家族成員的蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析(圖 2.3)，結(jié)果表明，克隆獲得的 NsylCIPK 家族所有成員都具有 DFG-APE 激活環(huán)結(jié)構(gòu)域、NAF 結(jié)構(gòu)域和 PPI 結(jié)構(gòu)域。說明這三個結(jié)構(gòu)域在 NsylCIPK 家族成員的進(jìn)化中非常保守，由此可推測它們在 NsylCIPK 發(fā)揮正常功能的過程中發(fā)揮重大作用。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 許迪之;林煙草NsylCIPK家族成員的克隆及其與NsylCBL10的互作分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

2 毛靜靜;林煙草NsylCBL10和NsylCBL5的功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

3 董連紅;林煙草CBL基因家族成員NsylCBL10的功能分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

本文編號：2713347