發(fā)布時(shí)間：2020-06-09 00:56

【摘要】：增強(qiáng)植株抵御鹽分和養(yǎng)分缺乏非生物脅迫逆境功能,對(duì)于改善作物生長(zhǎng)、發(fā)育及產(chǎn)量形成能力具有重要意義。本研究在前期實(shí)驗(yàn)室工作的基礎(chǔ)上,以鑒定的低氮、低磷和鹽分脅迫產(chǎn)生應(yīng)答的小麥耐逆因子TaMIR9658、TaMIR9773、TaMIR167a和TaCDPK17為基礎(chǔ),對(duì)上述耐逆因子分子特征及介導(dǎo)植株抵御非生物逆境的功能進(jìn)行了研究,主要結(jié)果如下:1.低氮脅迫下,小麥小分子RNA成員TaMIR9658的表達(dá)水平升高,在處理后12 h時(shí),表達(dá)量最高。采用瓊脂糖培養(yǎng)、溶液培養(yǎng)及土培培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明,在正常條件下,該小分子轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)與野生型(WT)相比沒(méi)有改變;低氮處理下,與WT相比,正義系植株長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng),葉面積及植株形態(tài)增大,反義系則長(zhǎng)勢(shì)減弱,葉面積及植株形態(tài)變小。表明TaMIR9658在植株適應(yīng)低氮脅迫中發(fā)揮正調(diào)節(jié)作用�；虮磉_(dá)分析表明,低氮脅迫下,硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NTNRT2.1和NTNRT2.2、硝酸還原酶基因NtNR1、亞硝酸還原酶基因NtNIR3、谷氨酰胺合成酶基因NtGS2、NtGS8和NtGS9在正義系中表達(dá)上調(diào),在反義系中表達(dá)下調(diào)。此外,細(xì)胞保護(hù)酶基因SOD1、POD1;4、POD4、POD1;7、CAT1;1正義系表達(dá)上調(diào),反義系表達(dá)下調(diào)。表明TaMIR9658介導(dǎo)植株抵御低氮逆境與其改善氮素吸收及增強(qiáng)細(xì)胞活性氧穩(wěn)態(tài)有關(guān)。2.TaMIR9773在鹽分脅迫下呈上調(diào)表達(dá),在處理后12 h時(shí)呈明顯上調(diào)。正常條件下,TaMIR9773轉(zhuǎn)基因系與野生型相比生長(zhǎng)特征相近。鹽分脅迫處理下,正義系形態(tài)較WT顯著增大,葉片數(shù)增多;反義系植株形態(tài)較WT變小,葉片小而少。其氣孔開(kāi)度觀測(cè)結(jié)果表明,鹽分脅迫下,正義系的氣孔關(guān)閉進(jìn)程較WT加快。表明TaMIR9773增強(qiáng)植株抵鹽分逆境的能力,與其調(diào)控氣孔開(kāi)閉及細(xì)胞水勢(shì)生理過(guò)程有關(guān)。3.采用TaMIR167a正義系、其靶基因NtARF6和NtARF8反義系研究了供試miRNA介導(dǎo)植株抵御低磷逆境的能力。在正常生長(zhǎng)及低磷處理下,供試轉(zhuǎn)基因株系的表型均較WT減小,生物量與WT相比也降低。表明miRNA167a在植物生長(zhǎng)和應(yīng)答低磷逆境中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。其中,低磷條件下轉(zhuǎn)化株系與WT相比的植株生長(zhǎng)抑制程度與正常生長(zhǎng)條件相比增大。研究表明,該小分子介導(dǎo)植株對(duì)低磷逆境的應(yīng)答與其調(diào)控細(xì)胞保護(hù)酶特定基因表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞活性氧穩(wěn)態(tài)有關(guān)。4.TaCDPK17全長(zhǎng)為1575kb,編碼氨基酸數(shù)目為194個(gè),等電點(diǎn)為9.11。TaCDPK17編碼蛋白具有信號(hào)肽,信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)位于第29和第30號(hào)氨基酸之間。TaCDPK17與TaCDPK10在核苷酸水平上高度相似,說(shuō)明上述基因具有相似的進(jìn)化途徑。在低磷脅迫處理下,與WT相比,超表達(dá)TaCDPK17正義系植株長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng),葉片數(shù)增多;該基因反義系則長(zhǎng)勢(shì)減弱,葉片數(shù)減少。表明TaCDPK17在介導(dǎo)植株抵御低磷脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要功能。綜上所述,小麥種屬miRNA家族成員(TaMIR9658、TaMIR9773和TaMIR167a)和鈣依賴蛋白激酶家族成員TaCDPK17在介導(dǎo)植物抵御非生物脅迫中發(fā)揮重要生物學(xué)功能。研究對(duì)于揭示小麥的耐鹽性,抵抗低氮和低磷的分子機(jī)制及今后為小麥遺傳改良和生產(chǎn)實(shí)踐提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

2.6.1.2 TaMIR9658 和 TaMIR167 轉(zhuǎn)基因系中活性氧清除相關(guān)基因的表達(dá)模式非生物脅迫誘發(fā)活性氧（ROS）產(chǎn)生，造成細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度加劇、細(xì)胞功能衰退和植株受到傷害。以用鑒定上述植株氮素吸收同化相關(guān)基因表達(dá)的 cDNA 樣品，對(duì)低氮脅迫下TaMIR9658 和低磷處理下 TaMIR167 轉(zhuǎn)化株系的煙草細(xì)胞保護(hù)酶編碼基因（超氧化物氣化酶SOD、過(guò)氧化物酶 POD 和過(guò)氧化氫酶 CAT）的轉(zhuǎn)錄本豐度進(jìn)行了檢測(cè)。供試 SOD 家族基因 5個(gè)，包括 NtSOD1、NtSOD2、NtFeSOD、NtMnSOD1和 NtMnSOD2）；POD 家族基因 11 個(gè)，包 括 NtPOD1;1、 NtPOD1;2、 NtPOD1;3、 NtPOD1;4、 NtPOD4、 NtPOD1;5、 NtPOD1;6、NtPOD1;7、NtPOD2;1、NtPOD2;2 和 NtPOD9；CAT 家族基因 6 個(gè)，包括 NtCAT、NtCAT-1、NtCAT1、NtCAT1;1、NtCAT1;2、NtCAT1;3 和 NtCAT3。用于擴(kuò)增上述基因的特異引物見(jiàn)圖 2-2。圖 2-1 用于 NRT、NR、NIR 和 GS基因擴(kuò)增的引物Figure 2-1 Primers used for amplification of NRT, NR, NIR and GS familygenes

2.6.1.3 TaMIR9658 和 TaMIR167 轉(zhuǎn)基因株系活性氧相關(guān)參數(shù)活性測(cè)定以低氮處理后 TaMIR9658和低磷處理后 TaMIR167轉(zhuǎn)化株系為材料，進(jìn)行細(xì)胞保護(hù)酶活和丙二醛含量的測(cè)定。其中，SOD活性采用周琦（2004）[137]的氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定；OD 活性采用高俊鳳（2006）[138]的愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；CAT活性采用鄒琦等（2004）[137]的紫分光比色法測(cè)定；MDA 含量采用高俊鳳（2006）[138]的硫代巴比妥酸比色法測(cè)定。2.6.2 TaMIR9773 鹽分脅迫下的氣孔特征研究在鹽分脅迫下，，因脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞滲透性失水，造成細(xì)胞的生理代謝過(guò)程受到影響。為了抗鹽脅迫，植物通過(guò)適應(yīng)性調(diào)整增強(qiáng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和抵御能力。其中，氣孔開(kāi)閉調(diào)節(jié)細(xì)胞勢(shì)和葉片蒸騰速率是植株適應(yīng)鹽分脅迫的重要生理機(jī)制。為闡明 TaMIR9773 調(diào)控葉片氣孔答鹽分逆境特征，以 WT和該小分子 RNA轉(zhuǎn)化株系為材料，觀測(cè) 6葉齡植株 NaCl（200M）處理后不同時(shí)間點(diǎn)（處理前 0 min 和處理后 30 min、1 h、2 h 和 3h）的葉片氣孔開(kāi)度。圖 2-2 擴(kuò)增 SOD、CAT和 POD基因的特異性引物Figure 2-2 Primers used for amplification of SOD, CAT, and POD family genes
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S512.1

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本文編號(hào)：2703929