【摘要】：串聯重復序列作為基因組的重要組成部分,大量存在于高等真核生物中。研究表明串聯重復序列的變化能夠對基因組以及染色體的結構產生重要的影響,進而導致基因功能的改變并使生物個體的性狀發(fā)生改變。因此研究串聯重復序列在染色體上的分布特點具有重要的意義。簇毛麥是小麥遠緣雜交育種中常用的基因資源,因此在育種材料中鑒定小麥背景中的簇毛麥染色體也是十分重要的。本研究主要以小麥、黑麥、大麥、簇毛麥、八倍體小黑麥和小麥-簇毛麥雙二倍體為材料,根據重復序列KU.D15.15、pSc119.2以及pTa71(rDNA)的4個重復序列家族設計寡核苷酸探針,對材料根尖中期染色體進行非變性熒光原位雜交(ND-FISH)分析,以研究串聯重復序列不同區(qū)段在小麥族染色體上的分布特點以及快速準確地鑒定小麥背景中的簇毛麥染色體。具體研究結果如下:1.本研究根據重復序列KU.D15.15設計了寡核苷酸探針Oligo-Ku,同時設計了微衛(wèi)星寡核苷酸探針(GT)_7。Oligo-Ku與(GT)_7相組合,能用于ND-FISH快速準確地鑒定出小麥背景中的簇毛麥染色體,寡核苷酸探針(GT)_7可以將7條簇毛麥染色體區(qū)分開。此外,探針Oligo-Ku也能識別小麥背景中的黑麥染色體。2.分析了來自小麥3B染色體上pSc119.2家族的序列3B.117(117bp),發(fā)現該序列被(T)n分隔為5個區(qū)段,根據這5個區(qū)段序列設計的7條寡核苷酸探針在相同的小麥、黑麥或簇毛麥染色體上呈現出了不同的信號強度以及不同的信號位點。同一條重復序列的不同區(qū)段在相同染色體上的不同位置的分布狀態(tài)是不同的。3.為了探究其他pSc119.2家族序列是否也有這樣的特征,從1B和3B染色體上隨機尋找了6條pSc119.2家族序列。經分析發(fā)現這些序列也由(T)n分隔為5個區(qū)段,根據這些區(qū)段分別設計36條寡核苷酸探針,并用這些探針與中國春根尖染色體進行ND-FISH分析。結果同樣發(fā)現由這6條pSc119.2家族序列不同區(qū)段設計的探針信號強弱不同,由第一、二、三和五區(qū)段設計的探針信號偏強,而第四區(qū)段的探針信號偏弱,且來自不同區(qū)段相同長度的探針產生的信號強弱不同,表明寡核苷酸探針信號強度與探針序列堿基構成有關。此外,由pSc119.2家族序列第五區(qū)段的整段序列設計的探針信號普遍很強,但由第五區(qū)段的部分區(qū)段設計的探針信號弱,這說明了寡核苷酸探針信號強度還與探針序列長度有關。4.小麥基因組中的pTa71有A、B、C、D四個不同的串聯重復序列家族。提取這四個重復家族的重復單元序列,根據各重復單元的不同區(qū)段設計寡核苷酸探針,在小麥、大麥、黑麥和簇毛麥染色體上進行ND-FISH分析。結果發(fā)現,由pTa71的A家族設計的探針信號最強,而B、C、D家族的探針信號都很弱并且在不同染色體上也呈現出了信號強弱差異。此外,由pTa71的A家族重復單元設計的兩條寡核苷酸探針(Oligo-pTa71A-1和Oligo-pTa71A-2)產生了不同的信號模式。Oligo-pTa71A-1和Oligo-pTa71A-2在小麥1B和6B染色體上有同樣強的信號,但Oligo-pTa71A-1在黑麥1R和簇毛麥1V染色體上的信號卻比Oligo-pTa71A-2的弱。5.為了探究由黑麥和簇毛麥中的rDNA重復序列是否也存在這樣的差異,從黑麥和簇毛麥基因組中克隆出共4條與pTa71的A串聯重復序列家族高度相似的序列71-R13-1、71-R4-1、71-R1-2、71-D7-6。將克隆的4條序列各分為三段,共設計了12條寡核苷酸探針,分別在黑麥和簇毛麥染色體進行ND-FISH分析。結果發(fā)現根據這4條序列的不同區(qū)段設計的寡核苷酸探針在黑麥和簇毛麥的1R和1V染色體產生的信號強弱也不同。推測該串聯重復序列不同區(qū)段在中期染色體中存在的狀態(tài)不同。本研究開發(fā)的寡核苷酸探針與ND-FISH分析相結合,能夠方便地從小麥背景中鑒定簇毛麥染色體。另外發(fā)現根據同一串聯重復序列不同區(qū)段設計的寡核苷酸探針在小麥族植物中期染色體產生的信號強弱以及信號位點的不同,反映了同一串聯重復序列的不同區(qū)段在小麥族染色體上的分布狀態(tài)不同。
【圖文】：

此外，對綿麥 367 材料進行ND-FISH鑒定，寡核苷酸探針Oligo-Ku和(GT)7信號只出現在其6VS染色體臂上（圖1C）。因此新設計開發(fā)出的寡核苷酸探針Oligo-Ku和(GT)7組合可以用于ND-FISH鑒定小麥和黑麥中的簇毛麥染色體。圖 1 寡核苷酸探針 Oligo-Ku 和(GT)7的 ND-FISH 結果。(A) 寡核苷酸探針 Oligo-Ku（紅色）在八倍體小黑麥 MK 染色體上的雜交結果，帶紅色信號的為黑麥染色體；(B) 核苷酸探針 Oligo-Ku和(GT)7在小麥-簇毛麥雙二倍體材料 TDV-1 染色體上的雜交信號，帶紅色和綠色信號的為簇毛麥染色體；(C) 寡核苷酸探針 Oligo-Ku 和(GT)7在小麥品種綿麥 367 的染色體上的雜交信號；(D) 寡核苷酸探針(GT)7在簇毛麥 7 對染色體上的 ND-FISH 信號。注：所有染色體均用 DAPI 進行染色（藍色），曝光時間 200ms。標尺：10μm。

3B.117串聯重復序列是由本實驗室從國際小麥測序中心（IWGSC）中國春小麥3B染色體測序數據庫中找出，該串聯重復序列與從黑麥中分離出的pSc119.2串聯重復序列有94% 的相似度，因此它們屬于同一個串聯重復序列家族。如圖2所示，3B.117序列可以通過紅色顯示的“(T)n”堿基序列將其分成5個區(qū)段。根據3B.117序列中這5個不同區(qū)段共設計了7條寡核苷酸探針（圖2，表3），其中寡核苷酸探針Oligo-3B117.2(25bp) 是這 7 條探針中堿基序列最長的。而探針 Oligo-3B117.2.1 (15bp) 是探針Oligo-3B117.2 (25bp)的部分序列，與其他5條寡核苷酸探針的堿基序列長度相似。在3B.117 序列最后一個區(qū)段上，將其分成了兩個部分并設計了寡核苷酸探針Oligo-3B117.6 和Oligo-3B117.1。分別將這些寡核苷酸探針在中國春小麥、黑麥PI428373和簇毛麥W6 21717的根尖細胞有絲分裂中期染色體上進行ND-FISH分析。圖 2 由“(T)n”將 3B.117 串聯重復序列分成 5 個區(qū)段，，設計 7 條寡核苷酸探針Fig.2 3B.117 tandem repeats divided into five segments by (T)n‖ and designed 7 oligonucleotideprobes.
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S512.1

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本文編號：2699834