【摘要】：人參(Panax ginseng C.A.Meyer)作為我國(guó)一味傳統(tǒng)的中藥材,吉林省的主要道地藥材之一,已有悠久的利用歷史。現(xiàn)代研究表明,作為人參活性物質(zhì)之一的人參皂苷Rb_1具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)心血管系統(tǒng)、延緩衰老等藥理活性,同時(shí)對(duì)腫瘤及糖尿病等疾病的治療發(fā)揮著重要作用。人參生長(zhǎng)周期長(zhǎng),皂苷產(chǎn)量較低,隨著市場(chǎng)對(duì)人參相關(guān)產(chǎn)品的需求日益增加與現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展,在分子水平深入挖掘人參皂苷Rb_1生物合成的關(guān)鍵基因資源,具有極其重要的理論與實(shí)踐意義。本研究通過分析人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得人參皂苷Rb_1生物合相關(guān)的基因群,命名為PgRb_1(A2),并對(duì)它們的表達(dá)模式進(jìn)行分析。將PgRb_1(A2)與已獲得功能驗(yàn)證的16個(gè)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行基因表達(dá)互作網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)PgRb_1(A2)與這些基因之間存在緊密的聯(lián)系;同時(shí),通過與人參皂苷Rb_1含量進(jìn)行相關(guān)性分析,在PgRb_1(A2)基因群中進(jìn)一步獲得與人參皂苷Rb_1含量緊密相關(guān)的重要候選基因PgRb_1S05和PgRb_1S08。利用qRT-PCR技術(shù)分析茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下PgRb_1S05和PgRb_1S08基因的表達(dá)量與人參皂苷含量的相關(guān)性,驗(yàn)證上述分析的準(zhǔn)確性。進(jìn)而通過基因克隆和DNA重組技術(shù)分離并驗(yàn)證PgRb_1S08基因的生物學(xué)功能,通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)PgRb_1S05酶蛋白。所得的結(jié)果如下:1.通過對(duì)人參皂苷Rb_1合成相關(guān)PgRb_1(A2)基因群的進(jìn)行表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)PgRb1(A2)基因群中各基因的表達(dá)與Rb_1含量呈顯著相關(guān),且分屬與不同蛋白家族,具有各自的表達(dá)特性。2.通過將PgRb_1(A2)與已獲得功能驗(yàn)證的16個(gè)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行基因表達(dá)互作網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)PgRb_1(A2)與16個(gè)關(guān)鍵酶基因之間存在緊密的聯(lián)系,且隨著Rb_1含量的增高,基因與基因間的聯(lián)系愈加緊密,參與的基因數(shù)目越來越多,篩選出與Rb_1高含量組相關(guān)的重要候選基因PgRb_1S05與PgRb_1S08。3.茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的人參發(fā)狀根中的總皂苷與單體皂苷Rb_1均呈現(xiàn)了顯著的升高,qPCR的檢測(cè)表明,PgRb_1S05與PgRb_1S08在不同皂苷含量下的基因的表達(dá)規(guī)律與基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果一致。4.通過基因克隆技術(shù)分離得到PgRb_1S08基因的全長(zhǎng)序列,其長(zhǎng)度為1836bp,編碼515個(gè)氨基酸,通過相關(guān)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析,其編碼的蛋白具有典型的胞泌復(fù)合體結(jié)構(gòu),與擬南芥中胞泌復(fù)合體EXO70B1蛋白亞基基因的同源性最高,擬南芥原生質(zhì)體亞細(xì)胞定位表明該蛋白主要定位在胞質(zhì)中,與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥T_2代植株,且在該代擬南芥中表現(xiàn)出促進(jìn)氣孔打開的特性。5.通過3’RACE與PCR技術(shù)獲得了PgRb_1S05的全長(zhǎng)序列,其長(zhǎng)度為1200bp,編碼399個(gè)氨基酸,通過序列比對(duì)得出,該蛋白為人參中的核黃素激酶,為多功能蛋白,并成功的構(gòu)建該基因的原核表達(dá)載體,通過Western鑒定該蛋白成功在大腸桿菌中表達(dá),為該蛋白功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

磷酸酯（FPP，F(xiàn)arnesene pyrophosphate），之后在鯊烯合酶[10]（SS）的作用下成角鯊烯（Squalene），并在鯊烯環(huán)氧酶（SE）[11]的作用下生成 2,3-氧化角鯊烯合成的第三階段為 2,3-氧化角鯊烯在一系類酶的催化作用下生成不同人皂苷單體的過程，而在植物體中，2,3-氧化角鯊烯為萜類物質(zhì)與甾醇類共同的體物質(zhì)，其分別在羊毛甾醇合酶[12]（LAS）與環(huán)阿屯醇合酶（CAS）的作用下成羊毛甾醇（Lanotsterol）與環(huán)阿屯醇（Cycloartenol），這兩個(gè)分支會(huì)生成固類（Sterols）物質(zhì)。當(dāng) 2,3-氧化角鯊烯在細(xì)樹脂合酶（β-AS）[13]的作用下會(huì)生β 香樹素（β-amyrim），其為齊墩果酸型五環(huán)三萜皂苷（例如:人參皂苷 R0）前體，當(dāng)在達(dá)瑪烷合酶（DDS）[14]的作用下生成達(dá)瑪烯二醇（Dammarenediol然后該物質(zhì)依次在，不同的單加氧酶細(xì)胞色素 P450[15]與糖基轉(zhuǎn)移酶[16]（UGT

圖 1-1 三萜類合成途徑Fig.1-1 Triterpenoid synthesis pathway下，生成不同的人參皂苷單體（例如：人參皂苷 F11、Re、CK、Rb1）。達(dá)瑪烷類型的人參皂苷分為原人參二醇（protopanaxadiol，PPD）和原人（protopanaxatriol，PPT）兩類，二者的區(qū)別是在第 6 位上，原人參三醇一個(gè)取代位點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.51

【參考文獻(xiàn)】

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2 傅文W，

本文編號(hào)：2697438