【摘要】：內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子作為一種特殊的化學(xué)信號(hào),可誘發(fā)植物細(xì)胞產(chǎn)生一系列與信號(hào)分子相關(guān)的生理生化效應(yīng),進(jìn)而誘導(dǎo)特定的基因表達(dá),激活次生代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性,最終導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的含量發(fā)生變化。然而,目前有關(guān)內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)藥用植物次生代謝產(chǎn)物合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)機(jī)制尚不完全清楚。本研究以苦豆子組培苗為研究對(duì)象,4株苦豆子內(nèi)生真菌的菌液濃縮物為真菌誘導(dǎo)子,考察其對(duì)苦豆子組培苗中氧化苦參堿(Oxymatrine,OMA)合成的影響,通過測(cè)定內(nèi)生真菌誘導(dǎo)苦豆子中防御酶的活性,探究?jī)?nèi)生真菌促進(jìn)生物堿合成積累的生理防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制;在內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子作用下,分析宿主中主要信號(hào)分子和次生代謝物OMA含量的變化規(guī)律,初步探討苦豆子內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對(duì)宿主中關(guān)鍵信號(hào)分子及生物堿的影響;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR),建立檢測(cè)苦豆子生物堿合成關(guān)鍵酶一賴氨酸脫羧酶(Lysine decarboxylase,LDC)基因表達(dá)的方法,研究?jī)?nèi)生真菌誘導(dǎo)子對(duì)宿主中生物堿合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響,在此基礎(chǔ)上,分析該基因的表達(dá)與宿主中OMA含量及信號(hào)分子之間的關(guān)系,揭示內(nèi)生真菌誘導(dǎo)苦豆子生物堿合成積累的作用機(jī)制。結(jié)果如下:1、以苦豆子內(nèi)生真菌的菌液濃縮物為誘導(dǎo)子,研究4種不同內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對(duì)苦豆子組培苗OMA的生物合成及生理防衛(wèi)反應(yīng)的影響。結(jié)果表明:4種苦豆子內(nèi)生真菌的菌液濃縮物均可提高宿主中OMA含量的積累,其中誘導(dǎo)效果最佳的是內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子XKYKDF40,在0～15d的誘導(dǎo)期間宿主中OMA含量持續(xù)增長(zhǎng)且始終高于對(duì)照,在15 d達(dá)到最高,為3.616 mg/g,是對(duì)照組15 d的2.09倍。4種內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子還可誘發(fā)宿主中3種抗氧化酶(POD、APX和CAT)和生物堿合成關(guān)鍵酶PAL的活性升高。2、在內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子XKZKDF11和XKYKDF40的作用下,分析在不同誘導(dǎo)時(shí)間下,宿主中主要信號(hào)分子NO、SA和JA含量以及主要活性成分OMA的變化規(guī)律,探究?jī)?nèi)生真菌誘導(dǎo)子誘發(fā)的信號(hào)分子同OMA含量及防御酶活性變化的關(guān)系,結(jié)果表明:在內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子XKZKDF11和XKYKDF40處理苦豆子組培苗后,首先誘發(fā)了信號(hào)分子NO迸發(fā),其次內(nèi)源SA和JA的釋放,他們達(dá)到最大值的時(shí)間分別在誘導(dǎo)第3、9和12 d,且在誘導(dǎo)過程中,3種信號(hào)分子參與調(diào)控PAL、APX和CAT活性的變化,隨后宿主中OMA含量的達(dá)到高峰。可推測(cè)NO、SA、JA三者聯(lián)合介導(dǎo)內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子XKZKDF11和XKYKDF400促進(jìn)苦豆子OMA的合成。NO的迸發(fā)是苦豆子組培苗在內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子處理下出現(xiàn)最早的反應(yīng)之一,信號(hào)分子SA和JA對(duì)內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子促進(jìn)OMA的合成有著拮抗或協(xié)調(diào)互補(bǔ)的作用。3、根據(jù)苦豆子LDC和Lectin基因序列設(shè)計(jì)目的和內(nèi)參基因,采用相對(duì)定量的方法,優(yōu)化qRT-PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件,建立苦豆子生物堿合成關(guān)鍵酶—LDC基因表達(dá)的檢測(cè)方法。結(jié)果表明:在qRT-PCR體系中cDNA濃度為200ng/μL,退火溫度為61℃時(shí)檢測(cè)結(jié)果最好;所構(gòu)建的目的基因QLDC和內(nèi)參基因Lectin的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其循環(huán)閾值與模板濃度均呈良好的線性關(guān)系,擴(kuò)增效率都在99%以上;與半定量PCR相比,qRT-PCR的靈敏度提高了 25倍；以內(nèi)生真菌XKYKDF40菌液濃縮物為誘導(dǎo)子,發(fā)現(xiàn)宿主中LDC基因的表達(dá)量始終與OMA含量協(xié)同增長(zhǎng),在誘導(dǎo)處理第15 d時(shí),LDC基因表達(dá)量達(dá)到最高,為誘導(dǎo)0d的260.95倍。4、在建立了穩(wěn)定的qRT-PCR檢測(cè)苦豆子LDC基因表達(dá)反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上,分析內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子XKZKDF11對(duì)生物堿合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響,探究LDC基因表達(dá)與宿主中OMA含量及信號(hào)分子之間的關(guān)系。結(jié)果表明:內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子XKZKDF11明顯促進(jìn)了宿主中LDC基因的表達(dá),且在各個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間段內(nèi),都高于同時(shí)期的對(duì)照組。在誘導(dǎo)0～12 d內(nèi),LDC基因表達(dá)量和OMA含量持續(xù)增長(zhǎng),在第12 d時(shí)LDC基因的表達(dá)量達(dá)到頂峰,為誘導(dǎo)0 d的394.41倍,是同時(shí)期對(duì)照組的21.26倍。結(jié)合宿主中信號(hào)分子的變化情況,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)處理期間JA與LDC基因表達(dá)量基本保持同步變化,推測(cè)JA參與介導(dǎo)內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子XKZKDF11促進(jìn)LDC基因的表達(dá)。
【圖文】：

１６０００００邋－逡逑１４０００００邋－逡逑＾邋１２０００００邋－逡逑Ｉ邋１００００００邋－逡逑，８０００００邋－逡逑＾邋６０００００邋－逡逑４０００００邋－逡逑０邐５邐１０邐１５邐２０邐２５邐３０逡逑時(shí)間邋Ｔｉｍｅ／ｍｉｎ逡逑圖２－２苦豆子組培苗中ＯＭＡ的高效液相色譜圖逡逑邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＯＭＡ邋ｉｎ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋５＊．邋ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ邋Ｌ．邋ｂｙ邋ＨＰＬＣ逡逑曲線的制備逡逑Ａ標(biāo)準(zhǔn)品２．０邋ｍｇ，用流動(dòng)相溶解定容至１邋ｍＬ，配制濃度為２邋ｍｇ準(zhǔn)Ｐｔ備液，梯度稀釋成濃度為２０００、１０００、５００、２００、１００和述色譜條件，吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，，每次進(jìn)樣１０邐以濃度（ｙ），進(jìn)行線性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：ｙ＝７９氧化苦參堿濃度在０．００２￣２．０００ｍｇ／ｍｌ范圍內(nèi)，峰面積線性關(guān)系１００００００邐＾７９４邋９邋ｘ＋１１７１３．２邋ｒ２＝0．邋９９９０逡逑

續(xù)光照１２ｈ，光強(qiáng)為１０００邋ｌｘ，包括添加誘導(dǎo)子當(dāng)天在內(nèi)每３ｄ取１次，共速凍后，－８０°Ｃ保存。逡逑子組培苗中ＮＯ含量測(cè)定逡逑Ｇｒｅｉｓｓ試劑法［１４３］測(cè)定組培苗中ＮＯ含量，配制ＮａＮ０２標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度從、２．５、２、１．５、ｌ｜＿ｉｍｏｌ／ｍＬ，繪制ＮａＮ０２＃準(zhǔn)曲線。�。希欤缈喽棺訜o菌苗子上研磨至勻漿，１００００ｇ，邋４°Ｃ離心１５ｍｉｎ，取上清，置冰上待測(cè)，按照表３－１２＃準(zhǔn)曲線中計(jì)算ＮＯ含量。逡逑表３－１邋ＮＯ含量測(cè)定操作表逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ邋ｔａｂｌｅ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ＮＯ逡逑試劑名稱邐測(cè)定管邐空白管樣品（叫）邐１００逡逑提取液（ｎｌ）邐１００逡逑試劑一（ｎＬ）邐５０邐５０逡逑試劑二（ｊｉＬ）邐５０邐５０逡逑棍勻，室溫靜置１０ｍｉｎ，于微量石英比色皿／９６孔板，測(cè)定Ａ５５Ｑ下的吸光值，ＡＡ＝ＡＭ－０．０８「邋１逡逑
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2695294