【摘要】：稻米是全球近一半人口的主食。提高水稻產(chǎn)量和改善稻米品質(zhì)是水稻基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中的兩個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。水稻種子大小/粒形直接影響水稻的產(chǎn)量,胚乳中淀粉和貯藏蛋白的含量與稻米的品質(zhì)息息相關(guān)。近年來(lái),影響水稻粒形和種子貯藏物質(zhì)積累的基因時(shí)有報(bào)道,然而這兩個(gè)重要性狀的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不明確。核因子Y(NF-Y)作為一類轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)過(guò)程。本研究選取5個(gè)水稻種子/胚乳特異表達(dá)的NF-Y基因(NF-YA8,NF-YB1,NF-YB9,NF-YC10和NF-YC12),通過(guò)創(chuàng)建基因表達(dá)抑制、基因功能缺失突變體和超量表達(dá)等遺傳材料來(lái)鑒定它們?cè)谒痉N子/胚乳發(fā)育中的功能,并對(duì)其調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了解析。主要結(jié)果如下:1.通過(guò)分析5個(gè)胚乳特異表達(dá)的NF-Y基因在水稻中花11中的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)具有胚乳特異性,此結(jié)果初步表明:水稻胚乳特異NF-Y基因可能參與水稻胚乳發(fā)育的調(diào)控。本研究中,我們利用RNAi技術(shù)和CRISPR技術(shù)創(chuàng)建了這5個(gè)胚乳特異NF-Y基因的轉(zhuǎn)基因遺傳材料,其中有2個(gè)基因的RNAi轉(zhuǎn)基因材料和5個(gè)基因的基因敲除突變體;同時(shí)還創(chuàng)建了2個(gè)基因的超表達(dá)材料。2.水稻種子特異表達(dá)因子NF-YC12是水稻貯藏物質(zhì)積累的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。NFYC12編碼一個(gè)NF-Y轉(zhuǎn)錄因子C亞基,qRT-PCR結(jié)果顯示其在受精后7 14天的種子中高表達(dá),原位雜交實(shí)驗(yàn)表明NF-YC12主要在種子糊粉層和淀粉胚乳部位表達(dá)。NF-YC12突變導(dǎo)致粒重顯著降低,種子堊白增加。掃描電鏡觀察顯示nf-yc12突變體成熟種子的淀粉顆粒形態(tài)異常、呈不規(guī)則排列。透射電鏡觀察結(jié)果表明nf-yc12突變體中淀粉顆粒的形成受到影響。此外,nf-yc12突變體中淀粉、直鏈淀粉和醇溶蛋白的含量均顯著降低,谷蛋白含量有所升高;淀粉的理化性質(zhì)(如支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)分布和淀粉的糊化特性)也發(fā)生改變。超表達(dá)NF-YC12能顯著提高種子粒形和粒重,同時(shí)超表達(dá)材料中種子貯藏物質(zhì)的積累也發(fā)生了變化。RNA-seq分析顯示,nf-yc12突變體中下調(diào)的差異表達(dá)基因與淀粉生物合成和能量?jī)?chǔ)備代謝過(guò)程相關(guān),qRT-PCR結(jié)果顯示,參與水稻種子淀粉合成和蛋白合成的基因在nf-yc12中的表達(dá)量明顯低于野生型,以上表明NF-YC12在水稻種子貯藏物質(zhì)的合成和積累過(guò)程中起作用。結(jié)合ChIP-seq和RNA-seq結(jié)果分析,通過(guò)ChIP-qPCR和酵母單雜交等實(shí)驗(yàn)證明了NF-YC12能直接結(jié)合OsSUT1(Sucrose Transporter)、OsGS1;3(Glutamine Synthetase1)和FLO6(FLOURY ENDOSPERM6)的啟動(dòng)子。同時(shí)qRT-PCR結(jié)果顯示在nf-yc12突變體中,這3個(gè)基因的表達(dá)出現(xiàn)明顯的下調(diào),表明OsGS1;3、OsSUT1和FLO6是NF-YC12直接作用的靶基因。NF-YC12和NF-YB1在體內(nèi)/外均能發(fā)生互作,結(jié)合兩者的表達(dá)模式的異同,我們解析了圍繞NF-YC12-NF-YB1參與調(diào)控胚乳發(fā)育和貯藏物質(zhì)積累過(guò)程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在糊粉層中,NF-YC12與NF-YB1互作,協(xié)同調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsSUT1的功能,此外NF-YC12通過(guò)直接結(jié)合并調(diào)控FLO6和OsGS1;3的表達(dá),來(lái)調(diào)節(jié)胚乳中貯藏物質(zhì)的合成和積累。3.水稻種子糊粉層特異表達(dá)因子NF-YB1調(diào)控胚乳發(fā)育和水稻灌漿。NF-YB1編碼NF-Y轉(zhuǎn)錄因子B亞基,在水稻種子糊粉層特異表達(dá)。NF-YB1表達(dá)下調(diào)或上調(diào)均導(dǎo)致種子堊白的增加,說(shuō)明NF-YB1表達(dá)的改變影響稻米的品質(zhì)。NF-YB1表達(dá)的改變不影響種子糊粉層的發(fā)育。NF-YB1表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致種子淀粉顆粒形態(tài)發(fā)生異常。與野生型相比,nf-yb1突變體(利用CRISPR創(chuàng)建的NF-YB1 knock-out突變體)種子粒重顯著降低,堊白率明顯增加。此外,nf-yb1突變體中總淀粉和直鏈淀粉的含量明顯降低,支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)分布發(fā)生改變。以上結(jié)果表明,NF-YB1在水稻胚乳發(fā)育和籽粒灌漿過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。4.水稻種子優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因NF-YC10調(diào)節(jié)水稻種子大小。NF-YC10具有胚乳優(yōu)勢(shì)表達(dá)的模式,qRT-PCR和原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NF-YC10在受精后5 10天的胚乳中高表達(dá)。NF-YC10蛋白定位于細(xì)胞核中,且該蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性。利用CRISPR基因敲除NF-YC10或RNAi抑制NF-YC10表達(dá)均產(chǎn)生小粒種子,粒重和粒寬明顯降低/減少。NF-YC10調(diào)控粒形可能是通過(guò)調(diào)節(jié)粒形相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)完成的。我們的研究鑒定了一個(gè)調(diào)控水稻粒形的新因子NF-YC10,其具有提高水稻種子大小和產(chǎn)量的潛力。5.水稻NF-YA8基因的表達(dá)模式和功能研究。NF-YA8啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明NF-YA8只在胚乳最外圍的糊粉層中表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示,NF-YA8在種子發(fā)育的中后期高表達(dá),在受精后7 10天達(dá)到峰值,與GUS染色分析的結(jié)果相一致,這說(shuō)明NF-YA8是一個(gè)糊粉層特異表達(dá)的基因。NF-YA8-GFP蛋白定位在細(xì)胞核中。酵母雙雜交結(jié)果顯示NF-YA8與NF-YB1和NF-YC12均不發(fā)生互作。NF-YA8突變之后種子外觀沒(méi)有發(fā)生異常。
【圖文】：

稻種子的生長(zhǎng)發(fā)育稻作為全球近一半人口的主要糧食來(lái)源，同時(shí)也是最重要的作物之一(Zuo)。去掉谷殼的水稻種子主要由果皮（pericarp）、種皮（teasta）、胚（embry（endosperm）組成，其中果皮和種皮是由母本組織發(fā)育而來(lái)，由珠被和珠是珠心表皮）形成種皮，，由子房壁形成果皮。胚和胚乳是雙受精的產(chǎn)物，精卵形成，胚乳是由受精極核形成的(SabelliandLarkins2009;Wuetal201發(fā)育是隨著種子發(fā)育同步進(jìn)行的。水稻種子發(fā)育主要分為 4 個(gè)階段：I. 胚期（0 2DAP），此時(shí)的胚乳細(xì)胞正經(jīng)歷有絲分裂；II. 細(xì)胞化時(shí)期（3 5DAP向四周產(chǎn)生 12-15 層胚乳細(xì)胞；III. 貯藏物質(zhì)積累期（6 20DAP），胚乳中淀粉和蛋白等物質(zhì)；IV. 種子成熟期（21 30 DAP），此時(shí)胚乳充實(shí)，直到和鮮重不再增加，形成成熟的種子（圖 1）(Agarwaletal2011;Wuetal2016

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆博士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文組織都用顏色來(lái)標(biāo)注；深綠色方框表示胚乳細(xì)胞處于活著的狀態(tài)，淺藍(lán)色方框表示胚乳細(xì)胞正在發(fā)生程序性細(xì)胞死亡（PCD），緊跟其后沒(méi)有顏色的方框表示細(xì)胞已不具有活性。CV，中央大液泡；DV，背部維管束；EN，胚乳；NU，珠心組織；P，果皮；SE，淀粉胚乳；T，種皮。Fig. 1 The dynamic changes of the rice seed development (Agarwal et al 2011; Wu et al 2016b)Changes in endosperm tissues at overall level and transversal sections during seed development arillustrated. Boxes underneath the drawing represent individual DAP. Major tissues are color-codedBoxesfilledindarkgreenindicateendospermcellsthatarealive,boxesinpalegreenindicateendospermcells are undergoingPCD, and boxeslacking color represent cells thathave losttheir membrane integritCV, central vacuole; DV, dorsal vascular tissue; EN, endosperm; NU, nucellar; P, pericarp; SE, starchendosperm; T, testa.作為水稻主要的貯藏組織，胚乳占據(jù)了種子大部分的空間。一個(gè)發(fā)育完整的胚乳主要由最外圍的糊粉層（aleuronelayer，AL）和里層的淀粉胚乳（starchendosperm，SE）組成（圖 2）(Zuo and Li 2014; Ishimaru et al 2015)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S511

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