【摘要】：稻米是全球近一半人口的主食。提高水稻產量和改善稻米品質是水稻基礎研究和生產實踐中的兩個關鍵科學問題。水稻種子大小/粒形直接影響水稻的產量,胚乳中淀粉和貯藏蛋白的含量與稻米的品質息息相關。近年來,影響水稻粒形和種子貯藏物質積累的基因時有報道,然而這兩個重要性狀的轉錄調控機制和調控網絡仍不明確。核因子Y(NF-Y)作為一類轉錄因子,參與調控植物生長發(fā)育的多個過程。本研究選取5個水稻種子/胚乳特異表達的NF-Y基因(NF-YA8,NF-YB1,NF-YB9,NF-YC10和NF-YC12),通過創(chuàng)建基因表達抑制、基因功能缺失突變體和超量表達等遺傳材料來鑒定它們在水稻種子/胚乳發(fā)育中的功能,并對其調控機理進行了解析。主要結果如下:1.通過分析5個胚乳特異表達的NF-Y基因在水稻中花11中的表達模式,發(fā)現(xiàn)它們的表達具有胚乳特異性,此結果初步表明:水稻胚乳特異NF-Y基因可能參與水稻胚乳發(fā)育的調控。本研究中,我們利用RNAi技術和CRISPR技術創(chuàng)建了這5個胚乳特異NF-Y基因的轉基因遺傳材料,其中有2個基因的RNAi轉基因材料和5個基因的基因敲除突變體;同時還創(chuàng)建了2個基因的超表達材料。2.水稻種子特異表達因子NF-YC12是水稻貯藏物質積累的關鍵調節(jié)因子。NFYC12編碼一個NF-Y轉錄因子C亞基,qRT-PCR結果顯示其在受精后7 14天的種子中高表達,原位雜交實驗表明NF-YC12主要在種子糊粉層和淀粉胚乳部位表達。NF-YC12突變導致粒重顯著降低,種子堊白增加。掃描電鏡觀察顯示nf-yc12突變體成熟種子的淀粉顆粒形態(tài)異常、呈不規(guī)則排列。透射電鏡觀察結果表明nf-yc12突變體中淀粉顆粒的形成受到影響。此外,nf-yc12突變體中淀粉、直鏈淀粉和醇溶蛋白的含量均顯著降低,谷蛋白含量有所升高;淀粉的理化性質(如支鏈淀粉的鏈長分布和淀粉的糊化特性)也發(fā)生改變。超表達NF-YC12能顯著提高種子粒形和粒重,同時超表達材料中種子貯藏物質的積累也發(fā)生了變化。RNA-seq分析顯示,nf-yc12突變體中下調的差異表達基因與淀粉生物合成和能量儲備代謝過程相關,qRT-PCR結果顯示,參與水稻種子淀粉合成和蛋白合成的基因在nf-yc12中的表達量明顯低于野生型,以上表明NF-YC12在水稻種子貯藏物質的合成和積累過程中起作用。結合ChIP-seq和RNA-seq結果分析,通過ChIP-qPCR和酵母單雜交等實驗證明了NF-YC12能直接結合OsSUT1(Sucrose Transporter)、OsGS1;3(Glutamine Synthetase1)和FLO6(FLOURY ENDOSPERM6)的啟動子。同時qRT-PCR結果顯示在nf-yc12突變體中,這3個基因的表達出現(xiàn)明顯的下調,表明OsGS1;3、OsSUT1和FLO6是NF-YC12直接作用的靶基因。NF-YC12和NF-YB1在體內/外均能發(fā)生互作,結合兩者的表達模式的異同,我們解析了圍繞NF-YC12-NF-YB1參與調控胚乳發(fā)育和貯藏物質積累過程的轉錄調控網絡。在糊粉層中,NF-YC12與NF-YB1互作,協(xié)同調控蔗糖轉運蛋白OsSUT1的功能,此外NF-YC12通過直接結合并調控FLO6和OsGS1;3的表達,來調節(jié)胚乳中貯藏物質的合成和積累。3.水稻種子糊粉層特異表達因子NF-YB1調控胚乳發(fā)育和水稻灌漿。NF-YB1編碼NF-Y轉錄因子B亞基,在水稻種子糊粉層特異表達。NF-YB1表達下調或上調均導致種子堊白的增加,說明NF-YB1表達的改變影響稻米的品質。NF-YB1表達的改變不影響種子糊粉層的發(fā)育。NF-YB1表達下調導致種子淀粉顆粒形態(tài)發(fā)生異常。與野生型相比,nf-yb1突變體(利用CRISPR創(chuàng)建的NF-YB1 knock-out突變體)種子粒重顯著降低,堊白率明顯增加。此外,nf-yb1突變體中總淀粉和直鏈淀粉的含量明顯降低,支鏈淀粉的鏈長分布發(fā)生改變。以上結果表明,NF-YB1在水稻胚乳發(fā)育和籽粒灌漿過程中發(fā)揮重要的作用。4.水稻種子優(yōu)勢表達基因NF-YC10調節(jié)水稻種子大小。NF-YC10具有胚乳優(yōu)勢表達的模式,qRT-PCR和原位雜交實驗結果顯示NF-YC10在受精后5 10天的胚乳中高表達。NF-YC10蛋白定位于細胞核中,且該蛋白具有轉錄激活活性。利用CRISPR基因敲除NF-YC10或RNAi抑制NF-YC10表達均產生小粒種子,粒重和粒寬明顯降低/減少。NF-YC10調控粒形可能是通過調節(jié)粒形相關基因的表達來完成的。我們的研究鑒定了一個調控水稻粒形的新因子NF-YC10,其具有提高水稻種子大小和產量的潛力。5.水稻NF-YA8基因的表達模式和功能研究。NF-YA8啟動子融合GUS報告基因實驗表明NF-YA8只在胚乳最外圍的糊粉層中表達。qRT-PCR結果顯示,NF-YA8在種子發(fā)育的中后期高表達,在受精后7 10天達到峰值,與GUS染色分析的結果相一致,這說明NF-YA8是一個糊粉層特異表達的基因。NF-YA8-GFP蛋白定位在細胞核中。酵母雙雜交結果顯示NF-YA8與NF-YB1和NF-YC12均不發(fā)生互作。NF-YA8突變之后種子外觀沒有發(fā)生異常。
【圖文】：

稻種子的生長發(fā)育稻作為全球近一半人口的主要糧食來源，同時也是最重要的作物之一(Zuo)。去掉谷殼的水稻種子主要由果皮（pericarp）、種皮（teasta）、胚（embry（endosperm）組成，其中果皮和種皮是由母本組織發(fā)育而來，由珠被和珠是珠心表皮）形成種皮，，由子房壁形成果皮。胚和胚乳是雙受精的產物，精卵形成，胚乳是由受精極核形成的(SabelliandLarkins2009;Wuetal201發(fā)育是隨著種子發(fā)育同步進行的。水稻種子發(fā)育主要分為 4 個階段：I. 胚期（0 2DAP），此時的胚乳細胞正經歷有絲分裂；II. 細胞化時期（3 5DAP向四周產生 12-15 層胚乳細胞；III. 貯藏物質積累期（6 20DAP），胚乳中淀粉和蛋白等物質；IV. 種子成熟期（21 30 DAP），此時胚乳充實，直到和鮮重不再增加，形成成熟的種子（圖 1）(Agarwaletal2011;Wuetal2016

華中農業(yè)大學 2019 屆博士研究生學位（畢業(yè)）論文組織都用顏色來標注；深綠色方框表示胚乳細胞處于活著的狀態(tài)，淺藍色方框表示胚乳細胞正在發(fā)生程序性細胞死亡（PCD），緊跟其后沒有顏色的方框表示細胞已不具有活性。CV，中央大液泡；DV，背部維管束；EN，胚乳；NU，珠心組織；P，果皮；SE，淀粉胚乳；T，種皮。Fig. 1 The dynamic changes of the rice seed development (Agarwal et al 2011; Wu et al 2016b)Changes in endosperm tissues at overall level and transversal sections during seed development arillustrated. Boxes underneath the drawing represent individual DAP. Major tissues are color-codedBoxesfilledindarkgreenindicateendospermcellsthatarealive,boxesinpalegreenindicateendospermcells are undergoingPCD, and boxeslacking color represent cells thathave losttheir membrane integritCV, central vacuole; DV, dorsal vascular tissue; EN, endosperm; NU, nucellar; P, pericarp; SE, starchendosperm; T, testa.作為水稻主要的貯藏組織，胚乳占據(jù)了種子大部分的空間。一個發(fā)育完整的胚乳主要由最外圍的糊粉層（aleuronelayer，AL）和里層的淀粉胚乳（starchendosperm，SE）組成（圖 2）(Zuo and Li 2014; Ishimaru et al 2015)。
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S511

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