【摘要】：對于像我國這樣的人口大國,糧食生產(chǎn)一直是全民關(guān)注的焦點,而我國60%作物種植以水稻為主。因此如何有效提高水稻產(chǎn)量已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最急需解決的關(guān)鍵問題。提高水稻產(chǎn)量有多條途徑,其中最直接有效的手段就是增強葉片捕獲光能的能力,以便提高光合作用,產(chǎn)生更多有機物。近年來,葉色突變體的出現(xiàn),使我們對植物葉綠體合成情況、發(fā)育機制有了重新的認識。為了研究水稻光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制,我們實驗室通過正向遺傳學(xué)的方法,克隆了一個控制株高和葉綠體移動的基因CRD1,為了進一步研究CRD1在葉綠體發(fā)育、細胞伸長等方面的功能,本實驗進行免疫共沉淀篩到了CRD1的互作蛋白CIP2。通過質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)CIP2是一類葉綠體GTP結(jié)合蛋白,其在調(diào)控葉綠體合成、高光下葉綠體移動上有重要功能。首先,為了驗證CIP2同CRD1的互作事實,我們通過雙分子熒光互補實驗、Pull-down以及酵母雙雜分別證實了CIP2跟CRD1的FH1+2結(jié)構(gòu)域存在互作關(guān)系。其次組織部位表達分析,發(fā)現(xiàn)CIP2在水稻葉片、葉鞘中都有較高的表達量,在水稻根中的表達量最低。亞細胞定位發(fā)現(xiàn)其定位在葉綠體,且跟CRD1共定位時,CIP2熒光信號會從葉綠體轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上。最后為了研究CIP2的形態(tài)及功能,我們利用micro-RNA技術(shù)創(chuàng)制了cip2-ami突變體。研究發(fā)現(xiàn)cip2-ami表現(xiàn)出淡黃葉,葉綠素含量降低表型。此外,RNA、蛋白水平表達量檢測發(fā)現(xiàn),在cip2-ami中CRD1上調(diào)表達,而crd1突變體中CIP2表達量也會上調(diào),暗示二者功能上可能具有相關(guān)性。但是二者具體遺傳學(xué)的上下游關(guān)系,還有待進一步探究。白條斑實驗發(fā)現(xiàn),在cip2-ami中白條斑出現(xiàn)的比野生型早,說明cip2-ami中葉綠體對強光反應(yīng)更敏感,而crd1則表現(xiàn)出對高光不敏感表型,因此推測CIP2是參與葉綠體避光反應(yīng)中的一個新的成員�？傊�,通過本實驗,我們發(fā)現(xiàn)CIP2是一個參與CRD1介導(dǎo)的葉綠體移動的新組分。CRD1與CIP2互作及它們參與的調(diào)控葉綠體遷移的機制,將為研究高光效育種、實現(xiàn)作物增產(chǎn)具有重要的理論意義。
【圖文】：

環(huán)狀尿卟啉原 III 可與亞鐵結(jié)合形成亞鐵血紅素，與鎂原卟啉[29,30]。鎂原卟啉添上一個甲基，環(huán)化成原脫植醇基葉綠素成葉綠素 a，而葉綠素 b 則是由少部分葉綠素 a 轉(zhuǎn)化而來。整個點受到阻斷，阻斷位點前面的物質(zhì)會不斷累積無法作為底物供應(yīng)點后面的產(chǎn)物會越來越少以致后面的過程都不能運行。經(jīng)過對葉段的剖析，研究者對于由葉綠素合成受阻引起的突變體大約總結(jié)律：在白化無法轉(zhuǎn)綠的突變體中，受阻位點大多發(fā)生在葉綠素合UroIII 之間；而可以轉(zhuǎn)綠的白化突變體中，主要是 Pchl 跟 Chla 之。隨著研究的不斷深入，，人們對葉綠素合成機制將會越來越清晰病變時可以第一時間推算出問題所在，有助于更快更有效的想到進一步研究葉色突變體，提高光能利用率，增加光吸收提高產(chǎn)量

圖 2.3.1Co-IP-MS 篩到 CIP2 蛋白Fig 2.3.1 Co-IP-MS sieve to CIP2 protein(a)免疫共沉淀篩到互作蛋白 CIP2; (b) CIP2 的蛋白質(zhì)譜分析(a)Immunoprecipitation screening to the interacting protein CIP2;(b) Protein profiling of CIP22.3.2 雙分子熒光素酶互補成像實驗前面我們用 Co-IP 的方法篩選到了 CRD1 的互作蛋白之一 CIP2，但是 Co-IP只能粗略的說明這兩者之間存在相互作用，而這種作用是直接還是間接的我們并不知道。為了進一步研究 CRD1 跟 CIP2 之間的相互作用，我們利用雙分子熒光互補技術(shù)（BiFC）[70]，探究植物體內(nèi)蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系。近年來基于熒光蛋白的深入探究，一些生物熒光研究互作的方法應(yīng)運而生，其中主要應(yīng)用到的有熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、雙分子熒光互補技術(shù)（BiFC）等。基于 BiFC[71]的原理，選取熒光蛋白的特異性位點，沿此切成 N 端和 C 端兩個多肽，而這兩段獨自存在的時候并不能發(fā)出熒光，但是當(dāng) N 和 C 端分別連到
【學(xué)位授予單位】：杭州師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S511

【參考文獻】

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本文編號：2694148